论文部分内容阅读
研究背景创伤、生理性和病理性骨吸收异常都可能会导致骨缺损,严重威胁着全球人们的生活与健康,而目前对于骨缺损的治疗仍旧面临着巨大的挑战。在针对骨缺损的治疗研究中,已经有大量的研究发现microRNA-17～92对成骨细胞增殖、分化等生物体功能具有非常重要的调控作用。小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)能够特异性表达成骨相关转录因子Runx-2和碱性磷酸酶等早期成骨分化表型标志物,已经被广泛应用于成骨分化的研究中。但在MC3T3-E1细胞成骨分化的研究中,关于miR-92a-1-5p是否能够通过特定的信号通路调控该细胞发生成骨分化,和发挥调控作用的分子机制是什么,目前还没有相关报道提出。研究目的探究miR-92a-1-5p是否通过Wnt/β3-catenin信号通路调控MC3T3-E1细胞成骨分化,并阐述miR-92a-1-5p发挥调控作用的分子机制。研究方法1、miR-92a-1-5p在BMP-2诱导MC3T3-E1成骨分化中的影响(1)使用BMP-2诱导MC3T3-E1细胞进行成骨分化,通过qRT-PCR和Western Blot检测诱导前后miR-92a-1-5p、ALP、Runx-2、OSX的表达水平。(2)采用MTT法检测诱导前后MC3T3-E1细胞的增殖情况。(3)在MC3T3-E1细胞中构建miR-92a-1-5p过表达或低表达模型,采用qRT-PCR检测过表达或干扰效率,以及ALP、Runx-2,OSX的表达情况,采用碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。(4)在 MC3T3-E1 细胞中转染 miR-92a-1-5p mimics 或 inhibitor,再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化7天,通过茜素红S法染色检测成骨分化能力。2、miR-92a-1-5p调控β-catenin抑制MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制研究(1)结合文献调研、生物信息学和在线数据库分析预测miR-92a-1-5p的下游靶基因。(2)在MC3T3-E1细胞中构建miR-92a-1-5p过表达或低表达模型,采用qRT-PCR、Western Blot检测 β-catenin的表达水平。(3)在MC3T3-E1细胞中转染miR-92a-1-5p mimics,再加入氯化锂(Licl)干预48h,采用qRT-PCR检测细胞中ββ-catenin、ALP、Runx-2、OSX的表达水平。(4)在MC3T3-E1 细胞中共转染miR-92a-1-5p mimics和GSK-3ββ siRNA,采用qRT-PCR、Western Blot检测 β-catenin、Runx-2、ALP、OSX的表达水平。(5)在MC3T3-E1细胞中转染miR-92a-1-5p mimics,再加入氯化锂(Licl)干预48h,然后再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化7天,通过ARS染色检测成骨分化能力。研究结果1、miR-92a-1-5p在BMP-2诱导MC3T3-E1成骨分化中的影响(1)使用BMP-2能够成功诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,随着诱导时间的延长,细胞中miR-92a-1-5p的表达水平逐渐下调,而成骨分化相关因子ALP、Runx-2,OSX的mRNA的表达水平逐渐上调。(2)诱导后MC3T3-E1细胞的形态为纺锤形、类长梭形或多角形,细胞核变大,但增殖能力比诱导前减弱。(3)转染了miR-92a-1-5pmimics后,细胞中成骨分化相关因子ALP、Runx-2,OSX的表达水平明显下调,细胞中ALP的活性也明显减弱;而转染了miR-92a-1-5p inhibitor后,细胞中成骨分化相关因子ALP、Runx-2,OSX的表达水平明显上调,细胞中ALP的活性增强。(4)在MC3T3-E1细胞中转染了 miR-92a-1-5p mimics并诱导成骨分化7天后细胞内形成的矿化结节明显减少,而转染了 miR-92a-1-5pinhibitor并诱导成骨分化7天后,细胞内形成的矿化结节明显增加。2、miR-92a-1-5p调控β3-catenin抑制MC3T3-E1细胞成骨分化的作用机制研究(1)分析预测结果发现miR-92a-1-5p可以与β-catenin的3’URT区域结合,说明miR-92a-1-5p的下游靶基因是β-catenin。(2)转染了miR-92a-1-5p mimics后,细胞中β-catenin的mRNA和蛋白表达水平明显下调;而转染了 miR-92a-1-5p inhibitor后,β-catenin的mRNA和蛋白表达水平明显上调。(3)在MC3T3-E1 细胞中转染了 miR-92a-1-5p mimics后,细胞中 β-catenin和成骨分化相关因子ALP、Runx-2、OSX的表达水平明显下调,而再加入氯化锂(Licl)干预后,细胞中β-catenin和成骨分化相关因子ALP、Runx-2、OSX的表达水平明显上调,显示Licd可以部分逆转miR-92a-1-5p对细胞中ββ-catenin和成骨分化相关因子表达的抑制作用。(4)在MC3T3-E1细胞中共转染了 miR-92a-1-5p mimics和si-NC后,细胞中β-catenin、Runx-2蛋白表达水平明显下调,成骨分化相关因子ALP、Runx-2、OSX的mRNA的表达水平也明显下调;而在MC3T3-E1细胞中共转染miR-92a-1-5p mimics和si-GSK-3β后,细胞中ββ-catenin、Runx-2 的蛋白表达水平明显上调,成骨分化相关因子ALP、Runx-2、OSX的mRNA的表达水平发生了上调,显示miR-92a-1-5p mimics可能与GSK-3β的作用一样,可以抑制下游靶基因ββ-catenin的表达。(5)在MC3T3-E1细胞中成功转染miR-92a-1-5pmimics,再加入氯化锂(Licl)干预48h,然后再诱导成骨分化7天后,与转染miR-92a-1-5p mimics相比,MC3T3-E1细胞成骨分化能力得到了增强。结论miR-92a-1-5p可以通过Wnt/β-catenin信号通路调控其关键蛋白β-catenin的表达,进而抑制MC3T3-E1细胞中成骨分化关键因子Runx-2、ALP、OSX的表达,最终抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。