研究背景乳腺癌是妇女目前最常见的恶性肿瘤之一，与其它恶性肿瘤一样，乳腺癌的发生与发展是由于机体的免疫功能低下，对肿瘤细胞缺乏强有力的免疫监视或杀灭，致使肿瘤细胞增殖、形成局部侵害和远处转移。由于机体免疫功能是决定乳腺癌患者预后好坏的最重要的因素之一，故免疫治疗是乳腺癌治疗和研究的一个重点。根据免疫应答的特异性，分为特异性免疫和非特异性免疫两大类，特异性免疫应答主要包括抗原递呈、免疫细胞活化和免疫效应三个阶段，其中免疫细胞活化是重中之重。淋巴细胞是主要的免疫细胞，活化需要两个相关的刺激信号，一是T细胞受体（T cell antigen receptor，TCR）识别MHC-抗原复合物后获得的抗原特异性信号（第一信号），该信号确保免疫应答的特异性；二是由B7-CD28等共刺激分子介导的抗原非特异信号（第二信号），该信号确保免疫应答在需要的条件下才能发生。两种信号在机体抗肿瘤免疫过程中缺一不可，当只有第一信号，缺乏第二信号时，T细胞处于无应答状态（又称为免疫无能状态，anergy）。相应地肿瘤免疫治疗分为特异性免疫和非特异性免疫治疗两大类，特异性肿瘤免疫治疗是肿瘤免疫治疗的重点，目前主要通过增强肿瘤抗原肽免疫原性、解除机体对肿瘤的免疫耐受和免疫抑制以及增强特异性主动免疫的细胞免疫抗原效应这几个途径来实施。但令人遗憾的是，到目前为止，虽然免疫治疗靶向性较强，且没有严重的毒副作用，但这些单纯的免疫治疗并没有取得突破性疗效。手术、放射治疗和化学治疗，给乳腺癌的治疗疗效的提高带来革命性的飞跃，通过这些手段，大量肿瘤细胞被杀灭，乳腺癌的高转移率有所降低，生存率不断提高，但是，国内外越来越多的学者注意到，这些治疗手段由于靶向性不强，在杀灭肿瘤细胞的同时，亦损伤了机体的免疫功能，从而影响患者预后。其中较为典型的是化疗，在杀灭肿瘤细胞的同时，一方面由于肿瘤负荷减轻，由肿瘤细胞直接诱导的免疫抑制一定程度上得到缓解，另一方面，化疗药物由于选择性抑制作用不强，破坏机体免疫系统、骨髓等造血系统，抑制T、B细胞等免疫细胞的产生。同时对胃肠道上皮细胞等也有一定毒性，加上药物所致胃肠道反应，致病人营养摄入不足，从而损伤机体的免疫功能。目前乳腺癌使用最广、公认疗效最佳的化疗药—阿霉素（ADM）及多西他赛（Docetaxal）均有较为严重的骨髓抑制和心脏毒性，限制了药物使用剂量，且常常威胁患者生命。如何在不降低疗效的前提下减少ADM及Docetaxal的用量，是目前临床迫切需要解决的问题。近年来，国内外不断有学者发现通过强化淋巴细胞活化的第二信号（共刺激信号，costimulatory signal）进行特异性肿瘤免疫治疗，治疗靶点更为明确、具体，可以更有效地抑制肿瘤细胞的增殖。就肿瘤治疗的策略而言，在多个水平发挥抗肿瘤效应的治疗手段的结合可获得最佳的治疗效果并减少耐药产生的机会，能否将强化淋巴细胞活化的共刺激信号与化疗结合，增强抗肿瘤效应，在不降低疗效的前提下减少化疗药用药剂量，从而避免由于大量运用化疗药物而带来的毒副作用，是这项研究的立足点，目前国内外已报告的同类的研究不多。CD40-CD40L与B7-CD28是淋巴细胞活化的两条最重要的共刺激通路（Costimulatory path），本课题选取CD40-CD40L通路作重点研究。研究目的1．研究乳腺癌患者免疫细胞活化共刺激通路CD40-CD40L（CD154）、B7-CD28的状况及手术、全身化疗对它们的影响；2．探讨CD40-CD40L、B7-CD28通路对乳腺癌细胞增殖的影响及其可能的机理；3．探讨激活CD40-CD40L共刺激通路对ADM及Docetaxal的协同作用及机理。研究意义将活化CD40-CD40L共刺激信号与化疗相结合，可能增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性，增强抗肿瘤效应，从而降低化疗药使用剂量，减轻化疗药物的毒副作用。这一方法有可能为优化现行乳腺癌治疗方案开拓新的思路，本课题有望为该思路提供初步的实验依据。方法1．70例乳腺疾病患者中，局部晚期乳腺癌48例分为A（接受改良根治术，22例）、B（先用CAF方案化疗再接受改良根治术，26例）两组，另22例乳腺良性病变为C组（接受乳腺肿物切除术）；三组患者分别二次清晨空腹抽取静脉血2ml，第一次在治疗开始当天；第二次A、C组于术后第三天，B组于化疗后第三天。用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）分析标本CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T、CD16⁺CD56⁺和共刺激因子及其配体CD40、CD40L、CD80、CD86、CD28表达。2．FCM分析乳腺癌细胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435（M435）、T47D、ZR-75-30及原代乳腺癌细胞（取自A、B组乳腺癌患者）的CD40、CD80和CD86表达，以及化疗前后的变化；3．在混合淋巴细胞培养（MLC）法增殖的Balb／c、KM和C57BL／6J近交系雄性小鼠脾脏细胞中，加入抗-CD154和抗-CD80功能阻断性单克隆抗体后，以MTT法（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色试验）检测MLC的淋巴细胞增殖变化；并测定诱导产生的淋巴细胞的免疫状态、免疫调节作用和免疫调节作用的抗原特异性，以及KM细胞和rmIL-2共同刺激对淋巴细胞的免疫状态的影响（以酶标仪测定的OD值代表活淋巴细胞数来衡量）。4．用MTT法测定rhCD40L、rhCD40L+IFN-γ、rhCD40L+ADM、rhCD40L+Docetaxal对CD40⁺的乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231增殖的影响；5．用碘化丙啶（PI）掺入法测定在rhCD40L干预下的MDA-MB-435、MDA-MB-231的细胞周期分布；6．MTT法检测MDA-MB-435、MDA-MB-231细胞膜分子CD80、CD86、CD54（ICAM-1）、CD95（Fas）、CD95L（FasL）、CD95L、HLA-DR的改变；7．用PCR法测定乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231凋亡相关基因bcl-xl，bax及趋化因子rantes基因的改变；8．统计学分析：数据以（?）±S表示，两组间比较采用两独立样本t检验（方差不齐，采用秩和检验），比较多组间差异时采用方差分析（若P＜0.05，方差齐时进一步先用LSD法行各组间两两比较，再用Dunnett法行各组与对照组的两两比较。方差不齐时进一步采用Tamhane法）。双侧检验，显著水平α=0.05，实验数据处理分析均在SPSS13.0统计软件包上实现。结果1．乳腺癌患者外周血中CD4⁺T、CD16⁺CD56⁺NK细胞数量低于正常对照组，有显著性差异（P＜0.05），CD8⁺T升高（P＜0.05）；手术后CD4⁺T降低（P＜0.05）。化疗后CD4⁺T降低（P＜0.05），CD8⁺T（P＜0.05）。手术+化疗后CD3⁺T、CD4⁺T、CD16⁺CD56⁺NK降低（P＜0.05），CD80、CD86、CD28降低（P＜0.05）。手术后CD80、CD86降低（P＜0.05）。化疗后CD86降低（P＜0.05），CD40升高（P＜0.05）。手术+化疗后CD80、CD86、CD40L降低（P＜0.05），CD40升高（P＜0.05）。2．与HBL-100相比，不同肿瘤细胞株表达HLA-DR分子的比例均不相同；5株乳腺癌细胞株CD40分子表达水平均提高，其中MCF-7、T47D和ZR-75-30有显著性差异（P＜0.05）。共刺激因子CD80降低，其中SK-BR-3、MDA-MB-43、MCF-7、T47D有显著性差异（P＜0.05）；CD86表达水平均降低，其中SK-BR-3、MDA-MB-435、MCF-7有显著性差异（P＜0.05）；乳腺癌原代细胞CD80（B7-1）、CD86（B7-2）的表达明显比对照组低（P＜0.05）；化疗后患者CD40、CD80、CD86水平均明显降低（P＜0.05）。3．用抗-CD154单克隆抗体时淋巴细胞增殖减少（P＜0.05），呈剂量依赖性；抗-CD154合并抗-CD80单克隆抗体时细胞增殖减少（P＜0.05）；外源性rmIL-2或KM细胞直接刺激阻断细胞（无能细胞），淋巴细胞增殖不明显（P＞0.05），两者合用无能细胞增殖明显（P＜0.05）；无能细胞用于BALB／c和KM之间的MLR时淋巴细胞增殖不明显（P＞0.05），并呈剂量依赖，但用于BALB／c和C57BL／6J之间的MLR时淋巴细胞增殖明显（P＜0.05）。4．CD40⁺的MDA-MB-435、MDA-MB-231乳腺癌细胞中加入rhCD40L后癌细胞增殖不明显（P＞0.05）；MDA-MB-435在48h G₁期细胞数量明显增加（P＜0.05），S、G₂期细胞数量较对照组下降（P＜0.05）；MDA-MB-231在72h G₁期细胞数量增加（P＜0.05），S期细胞数量明显下降（P＜0.05）；MDA-MB-231表面CD80、CD86、CD54（ICAM-1）、CD95（Fas）表达显著上调（P＜0.05），CD95L（FasL）表达显著下调（P＜0.05）；MDA-MB-435 CD95L、HLA-DR、CD86等分子在实验前后有显著性变化（P＜0.05）。且在4、24h bax／bcl-xl的比率均上调（P＜0.05）；5．加入rhCD40L+IFN-γ时MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞增殖不明显（P＞0.05）；加入rhCD40L+ADM、rhCD40L+Docetaxel时MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞增殖不明显（P＞0.05）。结论1．局部晚期乳腺癌患者存在免疫功能受损，全身化疗、手术等治疗手段可能使这种损伤加剧；淋巴细胞活化所需的共刺激信号减弱，手术、全身化疗可使该信号进一步弱化；2．乳腺癌细胞HLA-DR分子、共刺激分子的改变，导致共刺激信号减弱，可能是乳腺癌细胞发生免疫逃逸的重要原因；3．用抗-CD154单克隆抗体阻断CD40-CD40L共刺激通路、抗-CD80单克隆抗体阻断B7-CD28共刺激通路时，淋巴细胞的增殖可被抑制，联合应用时抑制更剧烈，且产生的无能细胞具免疫抑制作用，但这种免疫抑制作用有抗原特异性，且产生的无能状态可以逆转；4．用rhCD40L活化CD40-CD40L共刺激通路可抑制乳腺癌细胞增殖，它主要将细胞增殖阻滞在G₁期；rhCD40L与IFN-γ、周期特异性化疗药ADM、Docetaxel合用时抑制乳腺癌细胞增殖的作用更加强烈。