勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是一种临床上常见的男性疾病。ED的发生发展是一个多系统,多因素,长期,慢性的复杂过程,其发病机制仍不明确,因此积极探索ED的发病机制,对于寻找有效的防治措施,进而进行个体化的治疗具有重要意义。阴茎海绵体平滑肌(corpus cavernosum smooth muscle,CCSM)为阴茎勃起过程中的终末组织,处于重要的核心地位。平滑肌细胞分为收缩型和增殖型两种类型,收缩型的主要功能是收缩和舒张,维持组织器官的正常形态结构和功能,而增殖型主要在细胞增生、迁移、分泌及降解胞外蛋白等方面发挥作用。对表型的研究借鉴于血管平滑肌细胞(VSMCs),VSMCs从收缩型转化为合成型并获得增殖能力,这个过程称为表型转化。收缩型包含有以下几种标志物:肌动蛋白(a-actin,a-SMA),平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)、碱性调宁蛋白(calponin1)及钙调节蛋白(h-caldesmon)等,合成型的标志物主要是骨桥蛋白(OPN)。大量的研究表明高脂血症是ED发生发展的一个重要因素,高脂血症能使阴茎海绵体内皮和平滑肌细胞受损,导致阴茎海绵体功能的异常,但是高脂血症是否引起阴茎海绵体平滑肌的表型转化,即从收缩型向合成型转化,进而导致平滑肌的功能异常,目前尚未见报道。因此研究阴茎海绵体平滑肌的表型转化在高脂血症性ED的发病机制中具有重要意义。高脂血症介导ED的发生导致氧化应激的增加,目前NADPH氧化酶被认为是血管内生成ROS/超氧化物的主要酶体。高脂血症中ROS生成增多还可影响L-Arg-NO-CGMP通路的关键酶-鸟苷酸环化酶(GC)的表达和活性,进而使L-Arg-NO-CGMP通路障碍,导致内皮功能受损。然而,氧化应激是否介导了阴茎海绵体平滑肌的损伤及功能的异常,是通过L-Arg-NO-CGMP通路损伤内皮进而间接影响了平滑肌的功能,还是可以直接损伤平滑肌细胞,亦或是内皮与平滑肌同时发生损伤而共同导致ED的发生,目前具体的分子机制尚不明确。因此,氧化应激损伤可能是ED发病机制中的关键性因素,深入探讨氧化应激损伤对高脂血症ED阴茎海绵体平滑肌细胞病理改变以及功能结构损伤的调控分子机制,无论对于阐明ED的发病机制还是作为ED临床诊疗的重要靶标及预防ED的发生都具有重要意义。丹参酮ⅡA磺酸钠(Tanshinone ⅡA Sodium Sulfonate,STS)是我国传统中药丹参的提取物,具有保护心脏和抗动脉粥样硬化的作用,丹参酮ⅡA具有多种生物活性,包括抗氧化应激,舒张血管,抗动脉粥样硬化,抗炎和抗脂肪形成作用。STS是一种有效的抗氧化剂,通过清除脂质自由基和增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性,从而打破过氧化的链式反应,具有多靶点效应。临床上,我们在以STS改善心血管疾病的同时意外发现其对ED患者治疗也取得了较好的疗效。因此,我们推测,高脂血症引起氧化应激损伤诱导的阴茎海绵体平滑肌表型转化可能在ED的病理过程中起到关键作用,本研究以此为假设,通过建立高脂血症ED大鼠动物模型观察造模前后海绵体平滑肌细胞表型及氧化应激的变化,明确氧化应激损伤在ED发病过程的作用以及海绵体平滑肌细胞参与海绵体纤维化的方式;在此基础上进一步探讨STS是否通过抗氧化应激,改善平滑肌细胞的病理变化,从而发挥改善ED作用。相信这些研究成果将会丰富ED病因和病机理论,通过抗氧化应激改善ED患者有望为临床诊疗提供新策略。第一部分高脂血症ED大鼠CCSM细胞的表型特征及阴茎海绵体组织内氧化应激水平的变化方法:本研究采用高脂饮食喂养建立高脂血症大鼠模型,32只SD大鼠随机分为两组,分别在造模前后检测体重,总胆固醇(Total cholesterol,TC),甘油三酯(Triglycerides,TG),高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL),低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL),造模后使用海绵体神经刺激下阴茎海绵体压力测定评价勃起功能,同时测量颈动脉压力,计算其比值。采用HE染色检测组织细胞形态学改变,油红O染色测胸主动脉内膜脂质沉积;Masson染色法观察大鼠CCSM含量变化。qRT-PCR,Western blotting等方法检测阴茎海绵体组织平滑肌表型转化相关标志基因,蛋白Calponin,Myh11,OPN表达水平,检测平滑肌细胞表型调控因子Myocardin,免疫组化检测阴茎海绵体组织CollagenI,TGF-β表达水平;化学酶法测阴茎海绵体组织SOD,GSH水平,初步明确高脂血症ED大鼠体内氧化应激状态,阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化与ED的相关性。结果:HR组相对于NC组体重明显增加(P<0.001);通过阴茎海绵体压力测定及颈动脉压测定,计算最大阴茎海绵体刺激压/颈动脉压比率(intracavernous pressure/mean arterial pressure,ICP/MAP)比率,结果显示:MAP在HR组和NC组间总体比较差异没有统计学意义(P=0.282),ICP在组间总体比较差异有统计学意义(P<0.001),ICP/MAP在HR组比NC组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。HR&ED组TC,TG,LDL显著增高(P<0.001),HDL显著下降(P<0.05);HE染色结果显示HR&ED大鼠肝脏细胞结构紊乱,出现大量空泡样改变的脂质沉积;油红O染色结果显示HR&ED大鼠主动脉中膜层及外膜层出现了脂质沉积;与NC组比较,Calponin,Myh11及Myocardin mRNA在HR&ED组大鼠表达显著下降(P<0.05,P<0.05,P<0.001),而OPN显著增高(P<0.001);免疫印迹(Western blot,WB)证实Myocardin,Calponin和Myh11蛋白在HR&ED组大鼠阴茎海绵体组织中表达显著下降(P<0.05),而OPN表达增高(P<0.05)。免疫组化显示:HR&ED组中CollagenI,TGFβ的表达较NC组明显增多(P<0.05),提示HR&ED大鼠阴茎海绵体胶原的沉积与纤维化增多。Masson染色显示:HR&ED组大鼠CCSM数量增多,但与NC组比较差异没有统计学意义(P<0.05);HR&ED大鼠阴茎海绵体内SOD和GSH的含量较NC组显著降低(P<0.05).第二部分乙酰半胱氨酸(Acetylcysteine,NAC)对高脂血症ED大鼠勃起功能的影响方法:36只雄性SD大鼠随机分为4组,分别为正常组(NC),高脂血症组(HR),高脂血症+生理盐水组(HR+NS),高脂血症组+乙酰半胱氨酸组(HR+NAC),造模后分别进行阴茎海绵体内压测定,Masson染色评估阴茎海绵体平滑肌含量,化学酶法检测大鼠阴茎海绵体组织SOD,GSH,MDA,睾酮(Testosterone,T)水平,免疫组化,qRT-PCR,Western blotting 等方法检测阴茎海绵体组织CollagenI,TGF β,HO-1表达水平及平滑肌表型转化相关标志因子α-SMA,SMMHC,Calponin,Myocardin,OPN表达水平,初步探讨乙酰半胱氨酸(NAC)抗氧化在大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化中的作用。结果:ICP/MAP结果显示:MAP在各组间总体比较差异没有统计学意义(P=0.403),ICP在各组间总体比较差异有统计学意义(P<0.001),ICP/MAP在HR组分别与NC组,HR+NS组,HR+NAC组间比较差异有统计学意义(P<0.001,P=0.248,P<0.001)。与 HR 组比较,HR+NAC 组大鼠 TG 显著降低(P<0.001),HDL显著升高(P<0.001);HE染色可见高脂血症大鼠肝脏细胞结构紊乱,出现大量空泡样改变的脂质沉积;油红O染色结果显示HR和HR+NS组大鼠主动脉中膜层及外膜层出现了脂质沉积,部分伴有内膜的增厚,而HR+NAC组大鼠主动脉各层未见明显脂质沉积;HR+NAC组大鼠阴茎海绵体内SOD和GSH的含量较HR组增高(P<0.05)而MDA含量降低(P<0.05);与HR组比较,Myocardin,SMMHC mRNA在HR+NAC组大鼠表达显著增高(P<0.001),OPN显著降低(P<0.001);而α-SMA无明显统计学差异(P=1.000);相对于HR组和HR+NS组,HR+NAC组大鼠阴茎海绵体组织中SMMHC,Calponin和Myocardin蛋白表达升高(P<0.05),而OPN表达降低(P<0.05)。α-SMA虽有上调,但相对于HR组无统计学差异(P=0.699);免疫组化显示:相对于HR组,在HR+NAC组中HO-1的表达明显增加(P<0.05),而CollegeI,TGF β表达明显降低(P<0.05)。Masson染色显示:相对于HR+NAC组,HR组和HR+NS组大鼠CCSM数量增多,但各组之间比较差异没有统计学意义(P=0.243);血清睾酮在NC组,HR组,HR+NS组和HR+NAC组间总体差异没有统计学意义(P=0.081)。第三部分丹参酮ⅡA磺酸钠通过抗氧化应激改善高脂血症大鼠勃起功能障碍的机制方法:60只SD雄鼠随机分为5组,分别为NC,HR,HR+NS,HR+NAC,高脂血症+丹参酮ⅡA磺酸钠组(HR+STS),使用海绵体神经刺激下阴茎海绵体压力测定评估勃起功能,同时测量颈动脉压,计算其比值。qRT-PCR,Western blotting等方法检测阴茎海绵体组织中表型调控因子Myocardin,平滑肌表型转化相关标志因子α-SMA,SMMHC,Calponin,OPN的表达,血红素加氧酶1(HO-1),核因子E2相关转录因子2(NRF2)的表达。Masson染色法观察阴茎海绵CCSM含量的变化。免疫组化检测CollagenI,TGFβ,HO-1,eNOS的表达。化学酶法检测血清及阴茎海绵体组织SOD,GSH,MDA水平,探讨STS抗氧化改善高脂血症大鼠阴茎勃起功能的机制。结果:MAP在NC组,HR组,HR+NS组,HR+NAC组和HR+STS组间总体比较差异没有统计学意义(P=0.202)。ICP在各组间总体比较差异有统计学意义(P<0.001)。ICP/MAP在各组间总体比较差异有统计学意义(P<0.001),组间两两比较,NR组分别与NC组、HR+NAC组、HR+STS组比较,差异有统计学意义(P<0.001);HR+NAC组与HR+STS组比较,差异无统计学意义(P=0.253);与HR组相比,HR+STS组TG水平明显降低(P<0.05)。主动脉油红O染色可见HR+STS组大鼠胸主动脉各层未见明显脂质沉积;HR+STS组大鼠血清及阴茎海绵体组织SOD和GSH的含量较HR组增高(P=0.004和P=0.939,P=0.003 和 P=0.014)而 MDA 含量降低(P=0.004 和 P=0.001);相对于 HR 组和 HR+NS 组,α-SMA,SMMHC,myocardin mRNA 在 HR+STS 组表达显著升高,而OPN表达下调(P<0.05);相对于HR组,α-SMA,SMMHC,Calponin,myocardin蛋白在HR+STS组表达显著升高(P<0.05),而OPN表达下调(P<0.05);NRF2及HO-1在HR+NAC组和HR+STS组显著增高(P<0.05);相对于HR组和 HR+NS 组比较,CollagenI,TGF β 在 HR+STS 组表达下调(P<0.05),HO-1表达增高(P<0.05),eNOS表达增高(P<0.05)。Masson染色显示:NC组,HR组,HR+NS组,HR+NAC组,HR+STS组间CCSM 比较差异没有统计学意义(P=0.176)。大鼠血清睾酮(T)水平显示,各组间总体差异没有统计学意义(P=0.491)。结论:1.成功建立了高脂血症ED大鼠模型,发现其体内氧化应激水平增高;2.高脂血症ED大鼠模型导致了阴茎海绵体组织纤维化及平滑肌细胞的表型转化,即由收缩性向合成型转化。高脂血症大鼠CCSM细胞增殖表型与ED的发生有关;3.乙酰半胱氨酸(NAC)能提高HR&ED大鼠血清及阴茎海绵体组织内的抗氧化应激水平,抑制纤维化的过程,保持高脂血症大鼠CCSM的收缩表型;4.丹参酮ⅡA磺酸钠能提高高脂血症ED大鼠的抗氧化应激水平,保持阴茎海绵体CCSM收缩性表型,保护内皮的功能,改善勃起功能,其机制可能是通过NRF2/HO-1/Myocardin轴信号通路保持CCSM细胞表型起作用。5.丹参酮ⅡA磺酸钠可降低高脂血症ED大鼠甘油三酯水平,不影响其睾酮水平。