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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)归属于套式病毒目动脉炎病毒科属,由该病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)已成为世界养猪业生产中主要疫病之一。该病主要引起妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪的呼吸道症状和高死亡率。目前PRRS已经遍及全球主要养猪的国家和地区,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合,利用细胞内吞作用而感染易感细胞。现已报道的PRRSV感染Marc-145细胞的受体有CD163和Vimentin。CD163属于富含半胱氨酸超家族的清道夫受体蛋白,不但能够结合PRRSV,还能介导病毒在细胞内的复制。Vimentin是一个普遍存在于细胞内的波形蛋白,单克隆抗波形蛋白抗体可以阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染,对PRRSV非易感的BHK-21和CRFK细胞在表达了猴的波形蛋白之后变成了PRRSV易感细胞,同时波形蛋白与其它中间细丝蛋白组成的多聚体可能参与PRRSV在细胞内的复制和转移。我的导师周恩民教授利用所制备的针对PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2),从PRRSV易感细胞上发现了一个可能的PRRSV细胞受体蛋白。该蛋白为非肌肉肌球蛋白II型重链A(non-muscle myosin heavy chain II-A,NMHC II-A)。NMHC II-A广泛存在于自然界。在哺乳动物中,它是非肌肉肌球蛋白II型(NM II)重链的一个亚型,在整个细胞周期,包括细胞迁移、胞质分裂、细胞吸附和细胞形态变化过程中发挥重要的作用。已有研究证明NMHC II-A与T细胞上的趋化因子受体CXCR4结合,从而介导趋化因子的信号传导,可溶性CD163蛋白通过与T细胞上NMHC II-A的协同作用而结合T细胞,这些都说明了NMHC II-A在免疫反应中的作用。本文主要研究了NMHC II-A对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断作用。首先根据NMHC II-A羧基端基因序列人工合成七条多肽,通过病毒中和实验证明其中三条多肽对PRRSV感染Marc-145细胞有阻断作用。为探求NMHC II-A羧基端的生物学功能,从Marc-145细胞中提取总RNA,利用特异性引物,经RT-PCR克隆得到NMHC II-A羧基端基因(命名为PRA)。将PRA连接至pET-28a(+)原核表达载体,经诱导表达得到重组的NMHC II-A羧基端蛋白(命名为PRA蛋白)。经分段表达蛋白,Western-blot和I-ELISA实验证明了PRA蛋白能与Mab2-5G2特异性结合,并且找到了比较准确的结合位点。通过间接免疫荧光实验证明了PRA蛋白能够与Marc-145细胞的细胞膜特异性结合。更重要的是,通过病毒中和实验,荧光病毒中和实验,荧光定量PCR实验证明了PRA蛋白能够在一定程度上阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染。将重组质粒pEGFP-N1-PRA转染至Marc-145细胞,与未转染的Marc-145细胞相比,PRRSV感染转染pEGFP-N1-PRA的Marc-145细胞的能力降低了50%。另外,还证明了NMHC II-A的阻断剂(R)-(+)-Blebbistatin对Marc-145细胞的胞质分裂没有影响,但对PRRSV感染Marc-145细胞有阻断作用。这些实验结果充分证明了PRA蛋白在PRRSV感染易感细胞过程中的作用,为进一步研究PRRSV感染细胞的分子机制提供了一定的依据,也为进一步探求PRRS的防控提供了新的思路。