研究背景:肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病发病率日益升高,研究脂肪分化的相关调控过程,可能为未来减重新靶点提供更全面的理论依据,为治疗代谢性疾病提供新思路。初级纤毛是一种广泛存在于各种细胞表面的细胞器,由胞内运输系统IFT形成和维持,并且通过IFT实现信号的双向传输。初级纤毛在前脂肪细胞处于生长停滞期时形成,在分化过程中发生变化,其对脂肪细胞分化具有重要意义。在脊椎动物中,Hedgehog信号通路的维持完全依赖于初级纤毛。初级纤毛提供一个结构及功能室,使Hh通路得以应答。而Hedgehog通路与脂肪分化相关。肠细胞激酶ICK位于纤毛的基底部,可调控哺乳动物初级纤毛的长度。已有研究表明,当ICK发生突变的时候,ICK的功能缺失引起初级纤毛长度变化,且ICK突变对Hh信号通路的影响不仅取决于特定的组织和细胞环境,还取决于特定的生长发育阶段。本课题旨在研究ICK在前脂肪细胞分化中对Hedgehog信号通路的调控作用以及对其成脂分化的影响,而纤毛可能承担着介导作用。目的:1、观察初级纤毛在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中的定位及动态变化。2、探究ICK及Hedgehog通路下游基因Gli1、Gli2在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中的时序表达。3、验证抑制和激活Hedgehog信号通路对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的作用。4、探究shRNA沉默ICK基因对3T3-L1前脂肪细胞的初级纤毛、Hedgehog信号通路以及成脂分化的影响。方法:1、在诱导3T3-L1细胞分化到d0、d2、d4、d6、d8时进行初级纤毛的乙酰化α-tubulin、ARL13B免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察其初级纤毛的定位,对细胞中诱导产生的初级纤毛的长度进行测量并统计。2、在诱导3T3-L1细胞分化的d0、d2、d4、d6、d8分别提取其总RNA,qPCR检测ICK、Gli1、Gli2的mRNA表达情况。3、用Hh信号通路的抑制剂Cy及激动剂SAG对细胞进行干预,并设置对照组,诱导分化满8天后收取细胞,qPCR检测各组Hh信号通路标志基因Gli1、Gli2、Ptch1以及成脂标志基因PPARγ、CEBPα的mRNA表达情况,油红O染色法,观察各组3T3-L1细胞内脂滴形成情况。4、诱导分化转染ICK-shRNA组、阴性对照Vector组及空白Mock组3T3-L1细胞,在诱导分化d2时对细胞进行初级纤毛的免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察,并对初级纤毛的长度进行测量及统计。在d0、d2及d8分别提取各组细胞总RNA,检测Hh信号通路关键基因Gli1、Gli2、ptch1的mRNA表达情况以及d8时成脂标志基因PPARγ、CEBPα的mRNA表达情况。统计分析采用软件IBM SPSS Statistics 20进行统计学分析。统计数值的表示采用均数±标准差。统计曲线及图标的制作采用图表制作软件Prism(graph pad)。每组数据均采用非配对双尾t检验进行分析。以P<0.05表示显著性差异,P<0.01表示极显著性差异。结果:1、初级纤毛存在于脂肪细胞分化过程中,且在诱导分化的d2时纤毛最长,之后逐渐变短。2、在前脂肪细胞分化过程中,ICK在d2时mRNA表达量最低,Gli1和Gli2均在d2时mRNA表达量最高。3、抑制Hedgehog信号通路可以促脂肪分化,激活Hedgehog信号通路可以抑制脂肪分化。4、沉默ICK可以延长分化过程中前脂肪细胞的初级纤毛,上调Hedgehog信号通路Gli1、Gli2、ptch1的表达,并且抑制前脂肪细胞的成脂分化。结论:ICK是调控前脂肪细胞Hedgehog信号通路和成脂分化的关键因子,沉默ICK可以延长分化过程中前脂肪细胞的初级纤毛,激活Hedgehog信号通路,并且抑制前脂肪细胞的成脂分化。ICK可能是肥胖症等代谢性疾病预防及治疗的新靶点。