c-Abl (cellular Abelson gene product, c-Abl)是非受体酪氨酸激酶超家族Abelson的成员,在细胞生长和生存的许多重要信号通路,如细胞骨架重塑、细胞迁移和粘附、受体内吞作用、自噬、DNA损伤反应和细胞凋亡、促进自噬体进入溶酶体以及溶酶体组件的正常工作等方面都有重要作用。受到氧化压力刺激,c-Abl进入线粒体可以介导线粒体功能损伤和细胞死亡。正常情况下,细胞内c-Abl活性比较低,电离辐射或氧化应激时被激活。由于染色体易位形成BCR-Abl融合基因,其编码的BCR-ABL融合蛋白呈组成性激活状态,是导致慢性粒细胞性白血病(CML)的主要原因。c-Abl的抑制剂STI571(又称伊马替尼,格列卫)是90年代开发的酪氨酸激酶抑制剂类药物,是全世界第一个靶向小分子药物,在BCR-Abl阳性急、慢性白血病的治疗中发挥了重要作用。持续使用该药的病人,其预期寿命已与正常人群没有显著区别。有文献中已经报道STI571可以升高细胞的活性氧水平,同时将表皮生长因子抑制剂联合STI571用药可协同促进非小细胞肺癌细胞凋亡。线粒体是真核细胞氧化产能的重要场所,它通过内膜上的呼吸链复合物之间的协作,氧化还原呼吸作用底物并耦合电子传递产生ATP。在线粒体和亚线粒体颗粒以及完整的细胞中,呼吸作用除了可以维持细胞正常代谢之外,不可避免会产生一些活性氧族如H202、超氧阴离子、氢自由基及羟基自由基。特别是当线粒体呼吸作用受到抑制或者功能紊乱时,会大量产生活性氧族。线粒体产生的活性氧族对细胞会产生毒性,诱使细胞死亡。线粒体受到损伤后,其表面蛋白会被泛素修饰,并与溶酶体融合,以清除受损伤的线粒体,该过程被称为线粒体自噬(Mitophagy)。凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)定位于线粒体内膜上,是呼吸链复合物I的组成部分,具有维持线粒体稳态和促凋亡双重作用。正常生理条件下,AIF作为依赖于NADH的氧化还原酶,参与呼吸作用；当线粒体受损时,AIF经特定蛋白酶切割,从线粒体内膜脱离并转移到细胞核,引发染色体凝聚和DNA片段化,从而诱导细胞凋亡。但是AIF对细胞内ROS的产生及线粒体自噬的关系尚无相关报道。实验室前期研究结果已证实c-Abl能够与AIF相互作用,且导致AIF磷酸化。本研究在前期研究的基础上,首先通过免疫共沉淀,纯化在c-Abl表达细胞中表达的Flag-AIF, SDS-PAGE电泳分离出AIF蛋白,切取含有AIF的蛋白胶块,通过LC-MS/MS串联质谱鉴定,发现AIF蛋白的Y170和Y253可以被磷酸化。为进一步研究c-Abl对AIF的Y170和Y253位点的特异性磷酸化,针对Y170和Y253这两个酪氨酸磷酸化位点,我们合成了磷酸化的多肽,通过免疫家兔制备了相应的位点特异性磷酸化抗体,AIF-Y(170)-p-Tyr和AIF-Y(253)-p-Tyr。通过Y(170F)、Y(253F)单一突变体和Y(170253F)双突变体的免疫印记实验,验证这两个位点的特异性磷酸化。为研究c-Abl磷酸化AIF的生物学意义,我们设计并合成干扰AIF基因表达的siRNA序列,经过逆转录病毒载体包装、转染到A549细胞中,用嘌呤霉素筛选出基因组整合有干扰序列siRNA的阳性克隆株,并通过免疫印记验证,AIF基因表达水平降低80%以上,成功构建了AIF敲低的A549稳定细胞系。采用免疫荧光技术,绿色荧光二抗FITC标记AIF,红色Mitotracker red染料标记线粒体,在镜下观察发现AIF敲低的线粒体有片段化损伤现象。实验室前期研究结果已证实c-Abl抑制剂STI571能够造成线粒体损伤,进一步研究这一现象,我们发现c-Abl抑制剂STI571诱导非小细胞肺癌细胞等细胞的线粒体片段化甚至严重的肿胀损伤具有时间和剂量上的依赖性,提示我们c-Abl抑制剂STI571对于线粒体的损伤可能与AIF的定位改变有关。另一方面,通过免疫印记实验发现,STI571可以抑制c-Abl对AIF的磷酸化。为了探究c-Abl抑制剂STI571对于线粒体的损伤与AIF定位的关系,利用本实验室前期将AIF基因序列上C端的线粒体定位序列(MLS)替换为线粒体内膜锚定序列COX-Ⅳ并插入GFP标签载体上,构建的融合表达蛋白COX-AIF-GFP,使AIF能够锚定在线粒体内膜上而不被水解脱离线粒体。通过外源表达COX-AIF-GFP,免疫荧光实验观察到锚定在线粒体上的AIF可以缓解STI571对于线粒体的损伤。表明AIF在线粒体上的定位改变是c-Abl抑制剂STI571造成线粒体损伤的一个原因。为了研究AIF对STI571升高细胞ROS水平的影响,我们采用流式细胞术联合活性氧荧光探针DCFH来测定STI571处理AIF敲低的A549细胞系的平均ROS值,结果发现在敲低AIF的A549细胞中,STI571仍然可以大幅度升高ROS水平。表明的AIF可能对STI571诱导细胞ROS水平升高没有显著的影响。损伤线粒体可以和溶酶体融合得到清除。我们采用免疫荧光技术和溶酶体标志物LC3标记溶酶体的方法,在激光共聚焦显微镜下观察线粒体解偶联剂CCCP (20μM,6h,12h,24h)时间梯度处理、尼洛替尼(AMN,25μM,24h)的单一处理组和CCCP (20μM,24h)和另一种c-Abl抑制剂尼洛替尼(25μM,24h)联合处理研究c-Abl抑制剂尼洛替尼对A549细胞线粒体的自噬过程影响。我们发现,与对照组相比,随着CCCP处理时间的延长,聚集在线粒体上的LC3颗粒呈现先增多后减少的趋势,体现了线粒体自噬体的形成和逐渐被降解的过程。相比于CCCP(6-24h)梯度处理组,尼洛替尼单一处理也出现了线粒体上LC3颗粒数量增加,表明它同样可以诱导线粒体自噬的发生；但是对比CCCP单一处理(20μM,24h) LC3颗粒大量减少,尼洛替尼和CCCP共处理组24h则明显出现更多的LC3颗粒,表明不断形成的自噬体被滞留在溶酶体中而未被降解,最终导致自噬流的抑制。综上所述,本研究发现c-Abl抑制剂诱导线粒体活性氧水平升高可能与c-Abl磷酸化AIF无显著想关性；c-Abl抑制剂可以通过调控AIF在线粒体上的定位介导线粒体的损伤并诱导损伤线粒体自噬,但是抑制其自噬流。