【摘 要】
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目的:以家蝇抗菌肽attacin为目标基因,用自行建立的家蝇胚胎细胞系(MDEC-07114)及含有杆状病毒穿梭载体的Bacmid构建家蝇胚胎细胞真核表达系统,对表达产物抗菌肽attacin进行抗菌、
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目的:以家蝇抗菌肽attacin为目标基因,用自行建立的家蝇胚胎细胞系(MDEC-07114)及含有杆状病毒穿梭载体的Bacmid构建家蝇胚胎细胞真核表达系统,对表达产物抗菌肽attacin进行抗菌、热稳定性等生物学活性研究。方法:1、全基因合成家蝇抗菌肽attacin,将目的基因attacin克隆入PUC57质粒,重组质粒经双酶切后连接到pFastBacTMHTA供体质粒,制备重组杆状病毒BacmidDNA;2、重组杆状病毒Bacmid DNA转染家蝇胚胎细胞MDEC-07114,提取培养上清和细胞裂解物粗蛋白,SDS-PAGE检测目的蛋白,镍柱纯化粗蛋白;3、SDS-PAGE和Western-Blot检测、鉴定蛋白表达情况;4、表达产物生物学活性检测:对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)的抑制作用;经60-100℃水浴1-30min的热稳定性;经pH5.0-10.0的酸碱作用后的耐受性。结果:1、成功构建含家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体(Bacmid-pFastBacTM-attacin);2、重组杆状病毒Bacmid DNA成功转染家蝇胚胎细胞,细胞出现直径变大、停止生长、分离等现象;3、经SDS-PAGE检测培养上清和细胞裂解物粗蛋白均含有分子量为24KD的目的蛋白;4、镍柱纯化粗蛋白后经SDS-PAGE和Western-Blot检测证实含目的蛋白;5、生物学活性检测:表达产物抗菌肽attacin可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌活性;经60-100℃水浴1-30min及pH5.0-10.0酸碱作用后抗菌肽对大肠杆菌的抑菌活性影响不明显。结论:家蝇胚胎细胞MDEC-07114可用于杆状病毒-真核表达系统表达抗菌肽attacin;表达产物抗菌肽attacin具有生物学活性。
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