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第一部分突变CYP21基因表达载体的构建目的:21-羟化酶缺陷症(21-hydroxylase deficiency,21-OHD)是最常见的先天性肾上腺皮质增生(congenital adrenal hyperplasia,CAH),呈常染色体隐性遗传,约占全部病例的90-95%。本课题组在2个中国汉族CAH患者家系的基因分析中检测到两种错义突变,其中一个为首次报道的新突变P459H,另一个为稀有突变R483W,为明确两个点突变的意义以及进行基因型-表现型关联分析,我们采用体外实验的方法进行了功能学研究。首先对野生型CYP21cDNA分别进行P459H和R483W点突变,构建分别携带P459H和R483W突变的真核表达载体。方法:1.以质粒pCMV4-CYP21作为模板,分别设计两组特异引物,用高保真PfuDNA聚合酶催化PCR反应,在野生型CYP21基因上引入突变P459H或R483W,构建分别携带突变CYP21的真核表达载体:pCMV4-CYP21-R483W和pCMV4-CYP21-P459H。2.产物双向测序鉴定。结果:1.对突变产物进行BglⅡ和KpnⅠ双酶切,所得条带大小约为1800bp和4800bp。2.通过DNA双向测序证实,除导入的特异突变位点外无其它新的突变产生,突变的pCMV4-CYP21表达载体构建成功。结论:采用高保真Pfu DNA聚合酶,设计特定引物,可以成功引入目的基因突变,构建突变CYP21的重组表达载体,为体外研究点突变的意义提供了基础。第二部分CYP21基因突变的体外功能学研究目的:通过体外试验对两个错义突变P459H和R483W进行功能学研究,明确它们的的意义以及进行基因型-表现型关联分析。方法:分别将携带突变P459H和R483W的表达载体——pCMV4-CYP21-P459H和pCMV4-CYP21-R483W转染COS-7细胞,待其表达24～48h后,在培养基中加入其天然底物孕酮,检测产物11-DOC的产量,并计算不同CYP21蛋白催化孕酮生成11-DOC的转化率。以WT-GYP21的孕酮转化率作为100%,将突变CYP21的孕酮转化率与其作比,以所得比值来表示其残余酶活性。结果:1.点突变P459H和R483W都显著降低了CYP21对孕酮的催化活性。P459H突变的CYP21在体外实验中部分失活,残存的催化活性为6.8%(SD=2.1%),而R483W突变后的CYP21对孕酮的催化活性丧失至2.9%(SD=1.5%)。所有数据均经过student’t检验,p＜0.05。2.突变蛋白的三维结构分析显示459位脯氨酸位于一个袢环结构,P459H导致脯氨酸被置换为组氨酸后,可能与L螺旋的氨基酸残基L464或Q477发生相互作用,从而在一定程度上影响蛋白功能;R483W突变导致483位的精氨酸变成色氨酸后,可能与J螺旋的322位酸性氨基酸天冬氨酸及氨基酸残基以及L445或L446之间的相互作用消失从而影响蛋白结构。结论:1.P459H和R483W都显著降低CYP21的功能。体外实验结果显示两个点突变残余活性分别为6.8%和2.9%。2.根据基因不便导致的CYP21活性改变分类,P459H和R483均属于单纯男性化组,两个21-OHD病例的基因型和表现型一致。3.P459H和R483W突变改变了蛋白的三维结构或功能,降低了酶活性,这为分析CYP21结构-功能的关系提供了新的视点。