【背景】研究表明，酒精中毒性肝炎、病毒性肝炎、药源性肝炎及肝癌等多种肝病都与氧化应激有关。肝损伤的重要表现之一是发生肝细胞凋亡，研究肝细胞凋亡既是防治肝损伤的需要，也对诱导肿瘤细胞凋亡具有借鉴意义。P53作为重要的应激传感器，在ROS等不利因素的刺激作用下可诱导细胞发生凋亡。研究发现，细胞一旦出现氧化应激，p53就会大量表达，启动细胞凋亡。但是，p53是通过哪些作用因素或途经诱导细胞凋亡的，目前尚不完全清楚。最近有研究发现，在凋亡因子刺激下，p53可能转位到线粒体发挥作用。而线粒体作为能量生产场所，也是自由基、活性氧（ROS）衍生的主要部位，同时又可能是ROS攻击的主要靶点。然而，p53和线粒体以及细胞凋亡三者之间关系如何，至今仍然还是个“谜团”。葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOX），能高度专一性地催化β-D-葡萄糖与细胞内游离的氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢（H2O2）。由于GOX的催化底物葡萄糖和氧气在体内含量丰富，葡萄糖氧化酶催化ROS生成体系既是细胞内存在的常见反应，也可以作为一个生理环境下H2O2释放的理想模型。因此，采用GOX催化细胞内β-D-葡萄糖以产生内源性ROS，观察p53和线粒体相关因子的变化，研究凋亡发生与调控过程，以期阐明p53参与诱导肝凋亡的可能机制，为肝损伤防治研究提供新的思路。【目的】本项目通过葡糖糖氧化酶系统从体内和体外水平诱导肝细胞产生氧化应激，观察细胞和线粒体中ROS水平变化；研究ROS是否能够引起线粒体膜通道孔开放与膜电位改变，以及诱导p53的线粒体转位；探讨p53、线粒体应激和肝源细胞凋亡的关联性。具体研究目的如下：1．观察是否存在线粒体应激和p53线粒体转位，并探讨二者间的关联性。2．研究线粒体氧化应激过程中线粒体膜通透性和膜电位的变化。3．探讨线粒体应激条件下p53参与肝源细胞凋亡的调控过程。【方法】以HepG2细胞（人肝癌细胞）和Babl/c小鼠为研究对象，实验分为：(A)正常对照组、(B)GOX处理组、(C)PFT+GOX组、(D)CsA+GOX组。研究肝细胞线粒体氧化应激，线粒体膜结构与功能破坏，p53表达和亚细胞定位及凋亡相关分子变化。同时采用p53抑制剂（Pifithrin-a， PFT）与线粒体膜通道孔抑制剂（Cyclosporine A，CsA），进一步观察p53对线粒体氧化应激、线粒体膜的功能及凋亡相关因子的抑制作用；深入研究线粒体应激与p53线粒体转位参与调控细胞凋亡机制。1．细胞水平实验：采用HepG2细胞系作为实验对象，利用葡萄糖+葡萄糖氧化酶ROS生成系统。采用免疫荧光和亚细胞蛋白免疫印迹法，研究ROS对肝细胞p53蛋白含量和亚细胞定位的影响。测定线粒体中超氧阴离子自由基清除剂MnSOD表达，并使用Mito-SOXTM为探针测定线粒体ROS的生成。测定线粒体膜电位，线粒体膜通透性改变，线粒体细胞色素c释放，研究线粒体功能改变。提取线粒体、细胞质和细胞核，从整体和亚细胞水平分析细胞或组织中凋亡相关蛋白，如细胞色素c、bax、caspase3、caspase9、p53蛋白水平变化，以及氧化还原蛋白MnSOD变化。探讨氧化应激、p53水平、线粒体结构功能及肝源细胞凋亡之间的关系。2．动物水平实验：在完成细胞学研究的基础上，采用Balb/C小鼠作为研究对象，通过小鼠尾静脉射葡萄糖氧化酶，诱导小鼠肝脏的急性氧化损伤，并通过尾静脉给予Pifithrin-α和Cyclosporine A处理，生理盐水作为对照。主要观察指标如下：处理完成后，取出小鼠肝组织，测定氧化还原、p53蛋白定位、膜损伤、细胞凋亡等指标的的变化，测定方法与细胞实验一致。【结果】(1)给予一定剂量葡萄糖氧化酶处理后，HepG2细胞活力明显降低，细胞内ROS、MDA水平升高和GSH含量降低。MnSOD蛋白表达水平降低，Mito-SOXTM染色后线粒体超氧阴离子自由基水平显著升高，线粒体出现了氧化应激状态。(2) GOX处理后HepG2细胞p53表达水平明显升高， p53大量向线粒体聚集，与以往文献报道不同的是细胞核和细胞浆内p53水平无明显变化。(3) GOX处理后线粒体膜电位降低和膜通透性转运孔开放，细胞色素c由线粒体释放至细胞质中， Bax也由细胞浆向线粒体聚集，caspase-9、caspase-3激活。而AnnexinV/PI双染和TUNEL阳性率增加，表明大量细胞凋亡。(4)动物实验表明，葡萄糖氧化酶导致小鼠肝细胞线粒体MDA和ROS水平升高，GSH水平降低。尤其是p53水平上调并伴有线粒体转位，抗氧化酶MnSOD表达与活性降低，肝细胞大量凋亡。(5)给予p53抑制剂PFT（Pifithrin-α）和线粒体膜通道孔开放抑制剂CsA（Cyclosporine A）处理均可以一定程度上抑制HepG2细胞和小鼠肝脏p53的转位，修复或减轻线粒体应激损伤，细胞凋亡也明显减轻。【结论】(1)发现内源性ROS诱导肝细胞凋亡的调节因子p53蛋白，并不是像文献报道的那样在细胞核发挥作用，而是通过转位到线粒体发挥关键调控作用。(2)发现线粒体膜通透性改变和即膜电位下降可能是引起p53出现线粒体转位的重要途径；而转位到线粒体的p53通过调控MnSOD表达影响线粒体氧化应激。(3)发现p53可能通过两条途径诱导细胞凋亡：一方面p53调控线粒体氧化应激，导致线粒体膜电位降低和膜通透性转运孔开放，促进了细胞色素c由线粒体释放至细胞质中，同时激活caspase-9、caspase-3；另一方面调控凋亡蛋白Bax水平，Bax出现线粒体聚集，造成线粒体膜通透性改变。AnnexinV/PI双染和TUNEL阳性率变化也表明细胞出现大量凋亡。总之，通过GOX诱发线粒体氧化应激，促进p53上调表达与线粒体转位，导致线粒体膜电位降低和线粒体膜通透孔开放，启动凋亡因子释放，诱导肝细胞凋亡。修正了以往p53调控细胞凋亡主要发生在细胞核的观点。