论文部分内容阅读
目的：观察本实验室自制无血清培养基持续培养扩增hESCs对其“干性”的维持以及Notch1的表达变化趋势，以探讨该培养体系长时间培养扩增hESCs的效果以及Notch信号激活在维持hESCs“干性”中的作用。方法：收集自制无血清培养基传代扩增至第20代、30代的hESCs；应用免疫荧光染色法检测两代hESCs特异性标志OCT4、Nanog、SSEA-4的表达；碱性磷酸酶显色法检测两代hESCs碱性磷酸酶活性；体外接种hESCs至免疫缺陷小鼠，观察畸胎瘤形成，并行组织切片观察内、中、外三个胚层形成；应用Real-timePCR、Western-bolt技术，比较Notch1信号分子在两代细胞组分的表达情况，进行统计分析。结果：（1）免疫荧光染色法结果：两代hESCs细胞均表达OCT4、Nanog、SSEA-4，呈强阳性反应；（2）碱性磷酸酶显色结果示：显微镜下观察两代hESCs细胞均被染成蓝紫色，呈强阳性反应；（3）免疫缺陷小鼠畸胎瘤切片可见：分别注射了两代hESCs的小鼠形成的畸胎瘤切片染色提示均有内胚层、中胚层、外胚层组织的形成。（4）Real-time PCR技术比较Notch1基因在两代细胞中的表达情况：hESCs的Notch1基因表达第30代是20代的（8.4±0.23）倍，p<0.05。（5）Western-bolt技术比较Notch1蛋白在两代细胞中的表达情况：第30代hESCs的Notch1蛋白300kd片段相对表达量为（0.17±0.013），第20代为（0.016±0.002），第30代hESCs的Notch1蛋白120kd片段相对表达量为（0.41±0.021），第20代为（0.36±0.018），第30代hESCs的Notch1蛋白总表达水平明显高于第20代hESCs（p<0.05）。结论：（1）自制无血清无饲养层培养基能持续培养hESCs并维持其干性不变；（2）hESCs持续传代后，Notch1信号分子呈较高的表达状态，提示本无血清培养系统中hESCs在体外“干性”的维持可能与Notch信号激活有关，有待进一步研究。