研究背景和目的:卵巢癌（Ovarian cancer,OC）是发生于卵巢的恶性肿瘤,其死亡率极高,远超过子宫内膜癌和宫颈癌,位居生殖系统肿瘤的榜首[1]。据统计[2],仅美国2019年就发现22530名患卵巢癌,其中13980名死亡,且随着预期寿命的增加,每年诊断的病例数量也在增加,使得广大妇女生命健康受到威胁。卵巢癌最常见的病理类型是起源于卵巢表面的生发上皮即上皮性卵巢癌（Epithelia Ovarian Cancer,EOC）,约占OC的80-90%,其中约75%的EOC为浆液性上皮性卵巢癌[3]。超过90%的上皮性卵巢癌发生于40岁以上女性,其风险随年龄增长而增加。因为卵巢解剖位置比较隐秘,所以卵巢癌早期症状往往不具有典型性,此外因缺乏敏感性高、特异性好的早期筛查指标,因此70%患者一经发现就已经发生转移。关于卵巢癌发病机制和卵巢癌转移机制尚不明确,治疗上尚无重大突破。中晚期上皮性卵巢癌目前的治疗上仍以最大程度的肿瘤细胞减灭术和术后辅助以铂类等为主的联合化疗、免疫治疗和靶向药物治疗。尽管这些治疗在很大程度上提高了患者的总生存率,但大部分患者在短时间内将出现复发,5年存活率只有30%-40%[3]。卵巢癌的高致死性与缺乏早期的典型症状、缺乏早期监测的生物标志物、易发生远处转移和侵袭密切相关[4]。因此,寻找新的早期预测性生物标志物和寻找新的治疗靶点,深入了解卵巢癌转移机制成为目前迫切需要解决的问题。富含半胱氨酸肠道蛋白1（Cysteine-Rich intestinal Protein 1,CRIP1）属于LIM/双锌指蛋白家族成员之一,具有特征性的双锌指基序,因其结构上富含半胱氨酸残基,首次发现时是在肠道中高表达,因此被称为富含半胱氨酸肠蛋白,最初作为细胞内锌的转运和吸收蛋白被人们所认识[5]。随着研究的深入,越来越多的学者把目光投入到肿瘤上,他们发现CRIP1与人类多种恶性肿瘤密切相关,但是CRIP1在各种肿瘤中的表达及功能上存在报道不一致的情况。在转移性结直肠癌（CRC）中CRIP1高表达,下调CRIP1可抑制CRC细胞株SW620和HT29迁移和侵袭[6]。它可能作为一种调控CRC细胞的迁移和侵袭的癌基因,可能成为结肠癌不良预后和转移的一种新的生物标志物。在宫颈癌[7]、急性髓性白血病[8]和子宫内膜癌[9]中也发现了类似的结果。相反,在骨肉瘤[10]和乳腺癌[11]中,CRIP1却作为一种抑制基因,其高表达却预示预后良好和较少的转移可能。然而目前对CRIP1的研究有限,其介导的肿瘤转移机制尚不清楚。此外,卵巢癌与CRIP1的关系尚未报道。本研究旨在探讨CRIP1在上皮性卵巢癌中的表达,揭示其在卵巢癌致病的生物学特性及可能的致病机制。我们首先利用在线生物信息学分析技术,从TCGA数据库中筛选出卵巢癌中的致癌基因CRIP1,发现高表达CRIP1的卵巢癌,预后较差。随后,我们使用组织样本和细胞模型来验证其表达。并通过体外实验探讨其在侵袭、迁移和EMT中的作用,并进一步揭示其可能的机制。我们的研究结果将为CRIP1在上皮性卵巢癌的生物学功能和转移的潜在机制提供新的见解,并将为上皮性卵巢癌转移或进展提供新的肿瘤标记物,为治疗提供新的治疗靶点。方法:1、利用在线生物信息学技术网站,从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中下载数据并进行分析,挖掘出上皮性卵巢癌的差异表达基因。利用R软件的“Survival”和“Surv Miner”软件包,获得有生存意义的基因。排除已发表的的基因后,将获得既上调又有生存意义的基因,做出总生存期（OS）生存图,最后选定目标研究基因;2、通过免疫组化（IHC）测定50例上皮性卵巢癌组织和26例癌旁组织中CRIP1的表达情况,并分析CRIP1与临床病理参数的关系;3、采用Western blot和q RT-PCR方法,比较人上皮性卵巢癌细胞株（A2780和OVCAR3）和正常卵巢上皮细胞株（IOSE80）两组中CRIP1在蛋白和m RNA水平上在的表达情况;对高表达CRIP1的OVCAR3细胞株,使用三种不同的短干扰RNA（si RNA）敲减CRIP1的表达,同时利用Western blot和q RT-PCR检测转染效果;4、通过CCK-8、Ed U、Annexin V-FITC/PI凋亡实验、划痕和tanswell等细胞功能实验,观察上皮性卵巢癌细胞株OVCAR3敲减CRIP1前后,细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力变化;5、si RNA下调CRIP1的表达后,采用Western blot技术测定敲减CRIP1前后EMT相关的上皮和间质标志物蛋白（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）表达水平变化;6、通过KEGG途径进行富集分析,确定与CRIP1相关的卵巢癌致病的相关通路;采用Western blot测定Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白（β-catenin,GSK-3β,p-GSK-3β）及靶基因蛋白（MMP2和MMP9）的表达水平变化。结果:1、在线基因差异表达分析工具显示,在卵巢癌组织中有2613个基因显著上调,通过生存分析获得1378个生存显著基因,排除在Pub Med上发表358个基因。取三者的交集后,最终得到51个目标基因。将51个目标基因按-log10（P-value）排序,对排名前5位的基因进行生存和危害比（HR）分析,最后选定目标研究基因CRIP1。2、免疫组化评分显示,CRIP1蛋白在上皮性卵巢癌组织中表达高于癌旁组织（P＜0.05）,且与较高的病理分期和淋巴转移阳性相关,而与患者年龄、肿瘤直径和CA125水平无相关性。3、上皮性卵巢癌细胞（OVCAR3）的CRIP1蛋白和m RNA表达水平较人正常卵巢上皮细胞（IOSE80）显著升高（P＜0.01）;si RNA敲减OVCAR3细胞中的CRIP1后,CRIP1的蛋白和m RNA水平均明显下调（P＜0.01）。其中,si-229的沉默效果最好。4、细胞功能实验显示,si-CRIP1对OVCAR3细胞增殖和凋亡无明显影响（P＞0.05）,但能减弱OVCAR3细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.01）;5、用si RNA敲减OVCAR3细胞株CRIP1表达后,上皮性标记物E-cadherin上调,间质性标记物N-cadherin和vimentin下调（P＜0.05）;6、通过KEGG通路富集分析,我们发现CRIP1主要富集的通路为Wnt/β-catenin信号通路。si RNA下调CRIP1的表达后,Wnt/β-catenin通路中的关键蛋白β-catenin、p-GSK-3β及靶基因基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）等明显下调（P＜0.05）,而GSK-3β不变（P＞0.05）。结论:1、CRIP1是上皮性卵巢癌的一个致瘤基因,高表达的CRIP1与更高级别的肿瘤分期、淋巴转移阳性及预后差相关;2、在上皮性卵巢癌组织和细胞中高表达,高表达的CRIP1可促进肿瘤细胞的侵袭和迁移;3、CRIP1可能通过调控EMT相关的Wnt/β-catenin信号通路促进上皮性卵巢癌的侵袭和转移。本研究首次证明了CRIP1作为癌基因,可能通过调控EMT相关的Wnt/β-catenin信号通路,从而促进上皮性卵巢癌侵袭转移,提示CRIP1可能是上皮性卵巢癌转移和进展的重要生物标志物,可能成为后续上皮性卵巢癌治疗上重要分子靶点。