基于低共熔溶剂的分子印迹和磁固相萃取技术用于蛋白质的分离分析研究

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随着绿色化学时代的到来,人们越来越关注研究过程的环保性和可持续性。低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents,DESs)是21世纪的一种新兴绿色溶剂,由于具有挥发性低、化学稳定、生物相容性好且合成方法简单等特性,已广泛应用于分离分析的各个领域。DESs由一定比例的氢键供体(HBD)和氢键受体(HBA)组成,其结构具有可设计性。因此,根据分析物特性设计不同类型的DESs以满足目标需求成为目前研究的热点,深受研究者的青睐。分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology,MIT)是一种以“锁-匙”理论为基础,通过分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)特异性分离模板分子的技术。MIPs是抗体等自然特异性识别材料的良好替代品。目前小分子印迹已经发展得比较成熟,但生物大分子印迹领域受到一定限制。设计不同类型的DESs代替分子印迹过程中的传统功能单体和交联剂,能够提供更多与目标分子之间的相互作用,为生物大分子印迹提供了新的思路。磁固相萃取(Magnetic Solid Phase Extraction,MSPE)是一种以磁性材料为萃取剂,从复杂样品中预浓缩目标分析物的样品前处理技术,具有操作简单、分离快速等优点。设计合适的DESs对磁固相萃取剂进行修饰,有利于提高对目标分析物的萃取能力,增大萃取效率。本研究设计合成了不同类型的新型DESs,结合分子印迹和磁固相萃取技术,构建了牛血红蛋白、溶菌酶和胰蛋白酶的选择性分离分析方法。主要研究内容如下:(1)基于低共熔溶剂的磁性分子印迹聚合物用于牛血红蛋白的分离分析设计合成了一种基于DESs的新型磁性分子印迹聚合物(DESs-MMIP)。以甲基丙烯酸羟乙酯/四丁基氯化铵低共熔溶剂为功能单体,丙烯酰胺/(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵低共熔溶剂为交联剂,牛血红蛋白(BHb)为模板,通过表面印迹技术构建了DESs-MMIP。采用傅里叶红外光谱仪(FT-IR)、X-射线衍射仪(XRD)、透射电镜(TEM)、热重分析仪(TGA)和振动样品磁强计(VSM)等对DESs-MMIP进行了表征。通过对吸附条件的优化,DESs-MMIP对BHb的印迹因子高达21.89,最大吸附量为229.5 mg·g-1。与其他七种对比分析物相比,DESs-MMIP表现出对BHb的显著吸附效果。与文献中的方法比较结果表明,新型DESs-MMIP比用传统功能单体和交联剂构建的分子印迹聚合物对BHb具有更高的吸附能力和印迹因子。实际样品分析实验显示,DESs-MMIP可以从小牛血实际样中分离提取BHb。具有优异选择性的DESs-MMIP有望成为识别复杂样品中BHb的理想材料。(2)基于低共熔溶剂的石墨烯分子印迹聚合物用于溶菌酶的分离分析设计合成了以苄基三乙基溴化铵/α-甲基丙烯酸低共熔溶剂为功能单体,甲基丙烯酸羟乙酯/烯丙基三甲基氯化铵低共熔溶剂为交联剂,溶菌酶(Lyz)为模板分子,磁性氧化石墨烯为载体的分子印迹聚合物(DESs-MGO@MIP)。通过TEM、FT-IR、TGA、VSM和XRD等对合成的印迹聚合物DESs-MGO@MIP的尺寸、形貌和磁性等性质进行了详细的分析。采用吸附动力学和热力学实验,显示DESs-MGO@MIP对Lyz的吸附过程更符合Langmuir等温吸附模型和拟二阶动力学模型,吸附过程倾向于均匀的单层吸附,以化学吸附为主。在最佳吸附条件下,DESs-MGO@MIP对Lyz的最大吸附量达到174.6 mg×g-1,远高于牛血红蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白等其他八种对比分析物,印迹因子为2.4。DESs-MGO@MIP能从鸡蛋清实际样中成功分离Lyz,所拟方法对Lyz的分离纯化有较好的应用前景。(3)低共熔溶剂功能化的磁性二氧化钛用于胰蛋白酶的分离分析设计合成了甲基丙烯酸/氯化胆碱低共熔溶剂,通过自由基引发聚合的方法将其修饰在磁性二氧化钛纳米颗粒上,得到新型磁固相萃取剂(Fe3O4@Ti O2@DES),用于胰蛋白酶(Try)的分离分析。Fe3O4@Ti O2@DES的性能、组成和微观形貌等由FT-IR、TGA、XRD、VSM和TEM等进行了分析。在最佳条件下,Fe3O4@Ti O2@DES对Try的最大萃取吸附量达到475.7 mg×g-1。固相萃取吸附动力学和吸附等温线拟合研究显示,Fe3O4@Ti O2@DES对Try的吸附过程倾向于均匀的单层吸附,以化学吸附为主。重复利用实验结果表明,在四次重复利用后,萃取量仍维持在原来的87%左右。所拟方法可以用于牛胰脏粗提物中Try的萃取分离分析,结果满意。
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