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人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)是分离自人囊胚的内细胞团,具有自我更新和多向分化的潜能[1]。hESCs生长在灭活的小鼠成纤维细胞(即饲养层)上,培养基里需要添加血清替代物(Knockout Serum Reβlacement,KSR)和多种细胞因子(如ActivinA和bFGF等),但是在此条件下培养的hESCs生长速度十分的缓慢,不能耐受单细胞消化,容易凋亡[2]。虽然市场上出现了商品化的Matrigel可以部分的替代饲养层细胞,但是培养在Matrigel上的hESCs同样存在易分化和易凋亡等缺点,而且Matrigel操作麻烦,价格也相对比较的高。因此,寻找hESCs的新的培养方法已成为当前再生医学的热点研究方向之一。我们前期研究发现Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂IWR1可以改善目前hESCs培养的状况。IWR1是Tankyrases的一个抑制剂,Tankyrases的功能主要就是促进Axin蛋白的降解,Axin蛋白是β-catenin降解复合物的主要组成成分,所以小分子IWR1处理过的细胞可以稳定Axin蛋白从而降解β-catenin。虽然抑制Wnt/β-catenin信号通路可以促进hESCs的自我更新[3],但是具体的作用机制还不清楚。所以就得到了我所研究的课题:探究IWR1维持hESCs自我更新的分子机制。因为抑制Wnt/β-catenin信号通路可以促进hESCs的自我更新,所以我们就利用逆向思维来研究W nt/β-catenin信号通路是如何促进了hESCs分化,从而解析出IWR1维持hESCs自我更新的分子机制。本课题主要分为以下几个部分:第一部分:以前的文献报道过,β-catenin的过表达快速导致hESC分化[4]。因此,我们要首先需要确定β-catenin的这一功能。用PiggyBac载体(PB-Ctnnb1)使Ctnnb1在hESCs细胞株中的表达量提高。其中Ctnnb1在密码子33处含有激活突变(S33Y:即当33位的丝氨酸(S)突变成酪氨酸(Y),导致β-catenin不能被磷酸化降解,从而稳定其在细胞内的含量)。在添加了ActivinA/bFGFF/IWR1的培养基中培养6天之后,PB-Ctnnb1S33Y细胞中与分化相关的基因Cxcr4,FoxA 和Mixl1的表达含量显著升高,然而转有空载PB的对照细胞仍保留传统的hESCs形态,处于自我更新的状态。比如具有碱性磷酸酶染色的活性,高表达与多能性相关的基因Oct4,Nanog和TRA1-81。这些结果表明Ctnnb1的过表达不利于hESCs的自我更新。因此,我们确定Ctnnb1的过表达能够促进hESCs分化。第二部分:为了验证Ctnnb1是否通过其转录活性诱导hESCs分化,基于Ctnnb1S33Y基因的特定结构域,设计了一系列的缺失突变体[5-6]。Ctnnb1蛋白由781个氨基酸组成,基于此,我们做了以下几个突变体:Ctnnb1S33Y/△N48-217:Ctnnb1蛋白缺失N端第48到217的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△N218-467:Ctnnb1蛋白缺失N端第218到467的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△C468:Ctnnb1蛋白缺失C端第468到781的氨基酸,Ctnnb1S33Y/△C694:Ctnnb1蛋白缺失C端第694到781的氨基酸。将这些突变体形式的Ctnnb1插入PB质粒中并在hESCs中成功过表达。将其在添加了Activin/bFGF/IWR1的培养基中传代2次之后,进行了一系列的功能性验证后发现Cnnb1S33Y和Ctnnb1S33Y/△N48-217诱导hESCs分化。PB和Ctnnb1S33Y/△N218-467细胞中大多数hESCs仍然保持多能性。TOPFlash报告基因活性的结果显示,Ctnnb1S33Y和Ctnnb1S33Y/△N48-217强烈激活TCF依赖性转录,但是S33Y突变对TCF转录的影响在很大程度上由于某些Ctnnb1结构域的缺失而消除,例如C末端(S33Y/△C468和C694)或armadillo repeats 3-8(S33Y/△N218-467)。因此,我们的数据与之前的模型一致,其中Ctnnb1通过armadillo repeats 3-8与TCF结合并通过其C-末端激活转录[33],并且还表明Ctnnb1主要通过与LEF1/TCF家庭成员相互作用诱导hESCs分化。第三部分:LEF1/TCF家族转录因子含有四个旁系同源物(LEF1,TCF1,TCF3和TCF4),并且都能够与Ctnnb1相互作用[7]。为了确定Ctnnb1主要与LEF1/TCF家族中哪个基因相互作用诱导hESCs分化。我们在hESCs中分别过表达TCF因子,发现只有Tcf1过表达会导致hESCs明显的分化。与PB对照细胞相比,Tcf1过表达的hESCs细胞变得扁平,失去活性并且多能性基因Oct4和Nanog的表达水平较低,同时显示分化基因的表达增强,例如内胚层(Gata4和Gata6),中胚层(T和Mixl1)和外胚层(Fgf5)等标志基因。与此一致,免疫荧光染色显示大多数过表达Tcf1基因的细胞中GATA6表达呈阳性。这些结果表明Ctnnb1主要通过与Tcf1相互作用诱导hESCs分化。最后,为了确定Tcf1诱导hESCs分化的机制,我们对PB和PB-TCF1的hESCs进行了RNA-Seq分析来评估基因的表达模式。结果显示GATA6的表达显著升高。所以我们在过表达TCF1的细胞株中敲低Gata6了转录本,经过免疫荧光染色及qRT-PCR分析结果显示:与仅过表达TCF1的对照组细胞相比,过表达TCF1且同时敲低Gata6基因的hESCs中高表达自我更新标志基因Oct4和Nanog,而低表达分化基因Gata4,Gata6,FoxA2。这些结果表明GATA6可以调控Tcf1在hESCs中的功能。综上所述,本课题通过逆向思维,研究Wnt/β-catenin信号通路促进hESCs分化,进而解析了IWR1抑制Wnt/β-catenin信号通路维持人胚胎干细胞自我更新的分子机制,即IWR1抑制Wnt/β-catenin信号通路后,阻止了β-catenin与TCF1的相互作用,从而抑制了分化基因Gata6的表达,从而维持hESCs在未分化状态。研究结果扩大了人们对hESCs自我更新调控网络的认识。