目的： 1.预测和筛选EBV-LMP2多表位肽：预测EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的CTL和Th细胞表位，选择评分较高的CTL和Th表位，并结合本实验室预测的EBV-LMP2 B细胞表位[1]，获得EBV-LMP2多表位肽序列。 2.EBV-LMP2多表位肽的基因克隆及其原核蛋白表达和纯化：构建含EBV-LMP2多表位肽的原核重组质粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽，经IPTG诱导后用Western blot进行特异性鉴定。采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化融合蛋白EBV-LMP2多表位肽。同时纯化pET32a(+)表达的His蛋白用于动物免疫和ELISA检测的对照研究。 3.利用小鼠检测EBV-LMP2多表位肽的免疫原性：将纯化的EBV-LMP2多表位肽和His蛋白分别免疫BALB/c小鼠，隔周免疫，共3次。采用ELISA方法分析免疫后小鼠血清IgG及阴道分泌物sIgA水平及维持时间，并采用EBV抗原(B95-8细胞制备)作为阳性对照。同时，在末次免疫后1w无菌取小鼠脾细胞用LDH释放法进行CTL杀伤活性分析，以检测EBV-LMP2多表位肽免疫小鼠后诱导的特异性细胞免疫效应。本研究初步分析了EBV-LMP2多表位肽免疫原性，为EBV感染相关疾病的表位疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定了基础。 方法： 1.以EBV标准株(B95-8细胞)LMP2的完整氨基酸序列(497aa)为基础，应用在线预测网站SYFPEITHI(http：//www.syfpeithi.de/)，预测EBV-LMP2的H2-Kd、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0301、HLA-DR：B1*1501等限制性表位，尤其是HLA-A*0201、HLA-A*2402、H2-kd重叠的区域，选择含CTL、Th表位富集的肽段。结合本实验室已经报道的EBV-LMP2 B细胞表位[1]，选择B细胞表位及CTL、Th细胞表位富集的肽段作为多表位肽的候选序列。 2.将EBV-LMP2多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并将其插入原核质粒pET32a(+)，构建含有His标签的重组质粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。经IPTG诱导表达后的融合蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，并用Western blot鉴定其免疫原性，用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化融合蛋白EBV-LMP2多表位肽及His蛋白。 3.选择6～8周龄雌性BALB/c小鼠，分3组，即EBV-LMP2多表位肽组、His蛋白组及PBS组，每组9只。将纯化后的融合蛋白EBV LMP2多表位肽及His蛋白与佐剂等体积混匀后按照50μg/只剂量分别免疫小鼠，采用背部皮下多点注射的方式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后1w断尾取血并收集阴道分泌物，采用ELISA法检测血清中特异性IgG和阴道分泌物中特异性sIgA水平。同时，于术次免疫后1w，每组随机取3只小鼠，无菌取脾脏，制备脾细胞进行CTL细胞特异性杀伤活性检测，采用乳酸脱氢酶LDH释放法检测其特异性细胞免疫效应。其余小鼠持续检测其特异性血清IgG和阴道分泌物特异性sIgA的持续水平直至第7w。 结果： 1.从SYFPEITHI网站预测到的候选CTL和Th表位中选择出19条评分较高的肽段，结合本实验室已经预测的EBV-LMP2 B细胞表位[1]，选择CTL和Th细胞富集的肽段，即EBV-LMP2195-232和EBV-LMP2419-435肽段，将两段序列串联，即得到EBV-LMP2多表位肽序列。 2.酶切鉴定和核苷酸测序结果表明，成功构建了含有EBV-LMP2多表位肽的原核重组质粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。SDS-PAGE分析，在37℃，1.0mM IPTG作用下诱导6hr能很好地表达目的蛋白，相对分子质量(Mr)约为27kDa，与预期Mr大小吻合；蛋白表达量约占细菌总蛋白量的23％。Western Blot结果显示，以HRP标记的小鼠抗His-IgG(H+L)作为一抗，则可见单一明显条带，与SDS-PAGE中位置吻合。用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化得到表位融合蛋白EBV-LMP2多表位肽和pET32a(+)所表达的His蛋白。 3.BALB/c小鼠经融合蛋白EBV-LMP2多表位肽免疫后，可获得高效价的血清特异性IgG。血清抗体效价随免疫次数增加而升高，自第1w开始升高，可持续至第7w。用融合蛋白EBV-LMP2多表位肽蛋白包被并将血清按1：100稀释，检测第7w小鼠IgG抗体水平：EBV-LMP2多表位肽组A值为(1.178±0.130)，His蛋白组及PBS组分别为(0.468±0.121)，(0.016±0.008)； EBV-LMP2多表位肽组分别与His蛋白组及PBS组相比，均有显著性差异(P<0.05)； His蛋白组与PBS相比也有显著性差异(P<0.05)。 4.三组小鼠阴道分泌物特异性sIgA自第3w开始升高，至第5w达到高峰，然后下降。用融合蛋白EBV-LMP2多表位肽蛋白包被检测第5w小鼠sIgA抗体水平：EBV-LMP2多表位肽组A值为(0.754±0.064)，His蛋白组和PBS组分别为(0.455±0.038)，(0.171±0.018)； EBV-LMP2多表位肽组分别与His蛋白组及PBS组相比，均有显著性差异(P<0.05)； His蛋白组与PBS相比也有显著性差异(P<0.05)。 5.免疫小鼠CTL特异性的杀伤活性结果显示，随着效靶比的增加，EBV-LMP2多表位肽组的特异性杀伤率逐渐升高。效靶比为5：1、10：1、25：1时，EBV-LMP2多表位肽组的杀伤率分别为(12.52±2.59)％、(21.80±1.080)％和(23.68±3.74)％，His蛋白组和PBS组相应效靶比杀伤率分别为(3.72±1.18)％，(4.35±0.85)％，(7.15±2.09)％和(2.29±1.05)％，(4.12±0.42)％，(4.93±0.10)％。经统计分析，效靶比为5：1，10：1和25：1时，EBV-LMP2多表位肽组与His蛋白组和PBS组相比均有显著性差差异P<0.05)，而His蛋白组和PBS组相比则无显著性差异(P>0.05)。 结论： 1.预测并筛选了19个可能的EBV-LMP2的CTL表位和Th表位，结合本实验室已经预测的B细胞表位[1]，确定了EBV-LMP2多表位肽序列。 2.通过分子克隆技术，成功构建了含EBV-LMP2多表位肽的重组质粒pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽；在原核表达系统表达了多表位蛋白EBV-LMP2多表位肽；通过亲和层析法得到了纯化的EBV-LMP2多表位肽融合蛋白。 3.多表位肽融合蛋白免疫BALB/c小鼠的血清学检测结果表明，EB V-LMP2多表位肽能刺激机体产生全身及局部的特异性抗体：血清特异性抗体IgG效价随免疫次数增加而升高，自第1w开始升高，可持续至第7w；阴道分泌物特异性sIgA自第3w开始升高，到第5w达高峰，然后下降。 4.乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL特异性杀伤结果显示，EBV-LMP2多表位肽可以刺激机体产生较明显的特异性的CTL杀伤活性。本研究筛选的EBV-LMP2多表位肽，具有较强的免疫原性。