论文部分内容阅读
目的： 胸腺是T细胞分化成熟的中枢免疫器官，骨髓来源的淋巴细胞共同前体经血管和淋巴管进入胸腺，在胸腺分化成熟的T细胞再经血管、淋巴管输出到达外周免疫器官定居。血管和淋巴管是细胞迁入、迁出胸腺的必由之路，血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞在该过程中发挥关键作用。IFN-γ是具有多种生物学功能的细胞因子，对内皮细胞MHC分子和黏附分子的表达具有调节作用。另一方面，胸腺细胞从胸腺输出还与细胞分化成熟状态及CD62L、1-磷酸鞘氨醇受体1（sphingosine1-phosphate receptor1，S1P1）的表达高度相关。表达S1P1的胸腺细胞受1-磷酸鞘氨醇（sphingosine1-phosphate，S1P）的趋化而发生迁移。S1P主要由红细胞产生，在血液和淋巴液中的浓度高于淋巴器官，这种S1P浓度梯度是细胞迁出淋巴器官所必须的。近来还发现S1P裂解酶（S1P lyase，SPL）在胸腺基质细胞、胸腺髓质PVS区、血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞上表达，可催化S1P不可逆性降解，从而保持胸腺内S1P浓度在较低水平，是成熟胸腺细胞迁出胸腺的重要保证。 重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是器官特异性自身免疫性疾病，许多文献已报道MG患者胸腺及外周T细胞亚群比例异常，且在胸腺内形成针对AChR抗原特异性的Tfh和B细胞构成的生发中心，同时，MG患者胸腺中多种趋化因子异常高表达，提示MG患者胸腺和外周之间存在异常的淋巴细胞迁出或迁入。本课题组前期研究发现MG患者胸腺微环境中多种细胞因子表达异常，其中IL-6、TGFβ1、IFN-γmRNA表达与对照组胸腺相比明显增加。同时这些MG患者胸腺中S1P1+、CD62L+胸腺细胞增多，而且这些细胞大多聚集在脉管内或其周围，提示MG患者可能存在胸腺细胞输出异常。为探讨MG胸腺细胞异常输出与胸腺微环境中异常高表达的细胞因子IL-6、TGFβ1、IFN-γ之间的关系，本研究首先采用免疫组化和免疫荧光对MG胸腺组织中S1P1、CD62L、CD31、LYVE1的表达量和分布进行分析，其中S1P1、CD62L为介导胸腺细胞迁出的关键分子，CD31为内皮细胞的标志分子、LYVE1为淋巴管内皮细胞的标志性分子，然后采用人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）及人胸腺淋巴管内皮细胞（Human lymphatic endothelial cell，HLEC）培养，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot检测IL-6/TGFβ1/IFN-γ对HUVEC和HLEC黏附分子、趋化因子及SPL等表达的影响，分析MG胸腺微环境对血管及淋巴管内皮细胞介导胸腺细胞迁出的调控机理，为进一步研究MG胸腺异常的机制和提高诊疗水平提供科学依据。 方法： （1）研究对象：试验组为临床确诊的MG患者，AChRAb阳性，行胸腺切除术治疗，胸腺病理分型为非胸腺瘤，有典型滤泡增生；对照组为非MG心脏手术患者。 （2）MG胸腺细胞迁出相关分子的表达：取MG患者和对照组胸腺，进行石蜡包埋、制作组织切片，采用免疫组化、免疫荧光染色对胸腺组织中S1P1、CD62L、CD31、LYVE1的表达、分布及其相关性进行分析。免疫组化检测胸腺组织中ICAM-1、VCAM-1、SPL的表达与分布。免疫组化定量分析：应用ImageJ软件对胸腺组织石蜡切片免疫组化结果进行定量分析，采用累积光密度值（IOD）来表示组化结果的阳性程度。 （3）IL6/TGFβ1/IFN-γ对HUVEC生物学特性的影响：体外培养HUVEC，IL6/TGFβ1/IFN-γ刺激HUVEC后RT-qPCR检测ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5、CCL19、CCL21mRNA表达水平的变化；Western Blot检测ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表达水平的变化。 （4）IL6/TGFβ1/IFN-γ对HLEC生物学特性的影响：取先天性心脏病患儿胸腺，流式分选HLEC进行体外培养，IL6/TGFβ1/IFN-γ刺激HLEC后RT-qPCR检测ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5、CCL19、CCL21mRNA表达水平的变化；Western Blot检测ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表达水平的变化。 （5）IL6/TGFβ1/IFN-γ胸腺内注射对C57BL/6小鼠胸腺组织的影响：将IL6/TGFβ1/IFN-γ分别对C57BL/6小鼠进行胸腺内注射，免疫组化检测其胸腺组织结构的变化及胸腺内ICAM-1的表达与分布。 （6）统计学分析：用SPSS21.0统计学分析软件对实验结果进行统计学分析，首先进行正态性检验，符合正态分布，采用两独立样本之间的t检验，结果采用均数±标准差表示，当P＜0.05时，认为差异显著，有统计学意义。 结果： （1）MG胸腺细胞迁出相关分子的表达 ①MG胸腺中S1P1、CD62L、CD31和LYVE1的表达：免疫组化及免疫荧光结果显示MG胸腺组织皮髓结构分界较不明显，髓质区域缩小。MG患者S1P1+胸腺细胞和CD62L+胸腺细胞增多，且多分布在脉管内和其周围。MG患者胸腺中CD31+内皮细胞和LYVE1+淋巴管内皮细胞增多，在皮质、髓质均有分布。 ②MG胸腺中ICAM-1、VCAM-1和SPL的表达：MG患者胸腺组织中ICAM-1+细胞、VCAM-1+细胞及SPL+细胞数量均增多，ICAM-1+细胞和SPL+细胞大多分布在髓质区，VCAM-1+细胞多分布在小叶间。综上所述，提示MG患者胸腺细胞输出增多。 （2）IL6/TGFβ1/IFN-γ对HUVEC生物学特性的影响 ①HUVEC表达粘附分子、趋化因子和SPL mRNA水平的变化：IFN-γ刺激HUVEC后引起ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5mRNA水平显著增高（P<0.05），VCAM-1mRNA水平早期降低，72h表达增加，CCL19、CCL21mRNA水平降低（P<0.05）；IL6刺激HUVEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL mRNA水平增高（P<0.05），HLA-A、HLA-DR mRNA水平无显著变化（P>0.05），CCL21mRNA水平早期降低，随后增高，CCL5、CCL19mRNA水平降低（P<0.05）；TGFβ1刺激组ICAM-1、SPL mRNA表达水平早期增高（P<0.05），VCAM-1mRNA水平一过性增高，72hHLA-A mRNA水平降低（P<0.05），24hHLA-DR mRNA水平降低（P<0.05），CCL5、CCL19、CCL21mRNA水平显著降低（P<0.05）。 ②HUVEC表达ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白水平的变化：IFN-γ刺激HUVEC后ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表达水平增高；IL6刺激HUVEC后ICAM-1、SPL蛋白表达水平增高；TGFβ1刺激后ICAM-1、SPL蛋白表达水平增高。 （3）IL6/TGFβ1/IFN-γ对HLEC生物学特性的影响 ①HLEC表达粘附分子、趋化因子和SPL mRNA水平的变化：IFN-γ刺激HLEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5mRNA水平显著增高（P<0.05），CCL19mRNA水平早期降低，72h升高，CCL21mRNA水平显著降低（P<0.05）；IL6刺激HLEC后ICAM-1、HLA-A、CCL19、CCL21mRNA水平早期降低（P<0.05），SPL mRNA表达无显著差异（P>0.05），VCAM-1、HLA-DR、CCL5mRNA水平随时间的增加而升高，72h升高明显（P<0.05）；TGFβ1刺激组ICAM-1、VCAM-1、HLA-DR mRNA水平显著降低（P<0.05），SPL mRNA表达无显著差异（P>0.05），HLA-A、CCL5、CCL19、CCL21mRNA水平早期降低（P<0.05）。 ②HLEC表达ICAM-1、VCAM1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白水平的变化：IFN-γ刺激HLEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表达水平增高；IL-6刺激组HLA-DR蛋白表达水平增高；TGFβ1刺激组HLA-DR蛋白表达水平降低。 （4）IL6/TGFβ1/IFN-γ胸腺内注射对C57BL/6小鼠胸腺组织的影响 IL6/TGFβ1/IFN-γ分别对C57BL/6小鼠进行胸腺内注射后，组化结果显示IFN-γ及IL6注射组小鼠胸腺组织皮髓结构界限不明显，髓质区域缩小。IFN-γ注射后，小鼠胸腺内ICAM-1的表达量显著增加，这些改变与MG患者胸腺有相似之处。 结论： MG胸腺微环境异常高表达的IFN-γ可通过增高血管和淋巴管内皮细胞SPL、黏附分子的表达，进而促进S1P1+和CD62L+细胞从胸腺输出。