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目的:乳腺癌（breast cancer,BC）是女性最常见的癌症,也是癌症相关死亡的常见原因。尽管早期发现显著降低了BC的死亡率,但发生转移的患者预后仍然很差。淋巴结转移是BC患者最重要的预后因素之一[1]。鉴于其重要的临床意义,早期准确判断淋巴结状态和探索其发生的分子机制十分重要。腋窝淋巴结转移是BC患者总体复发和生存的重要预测因素,准确评估淋巴结受累情况是BC分期的重要组成部分。前哨淋巴结活检（sentinel lymph node biopsy,SLNB）可使前哨淋巴结阴性的BC患者避免腋窝淋巴结清扫（axillary lymph node dissection,ALND）,从而减少术后上肢水肿、活动障碍等并发症[2]。然而,SLNB是一种有创性操作。因此,腋窝成像的关键作用是评估淋巴结状态以指导治疗决策。早期BC腋窝淋巴结形态学表现不典型,利用常规超声或X线等方法术前判断淋巴结有无转移的准确性有限。超声光散射断层成像（diffuse optical tomography,DOT）是近年来发展的一种无创性功能性成像方法,通过探头发射近红外光,测量乳腺病灶总血红蛋白浓度（total tumor hemoglobin concentrations,TTHC）,间接反映组织内血管分布和氧和状态,不受血流速度和方向的影响,定量反映病灶内的血供情况。目前,关于DOT预测BC淋巴结转移的研究较少,有学者认为伴有淋巴结转移的BC原发病灶的血红蛋白浓度较未转移组显著增加[3]。分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1,SPP1）,又称骨桥蛋白,是一种存在于细胞外基质的分泌型磷酸化糖蛋白,在恶性肿瘤的增殖侵袭等进展中发挥重要作用[4]。SPP1也是一种血管生成因子,BC中SPP1阳性者微血管密度较SPP1阴性者明显增多。血管生成是BC细胞侵袭和转移的有利条件,新生血管丰富的肿瘤有较高的转移率。同时,生物信息学分析显示,SPP1与BC上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的关系密切,并且与预后相关。综上,我们推测SPP1可能参与了BC转移过程。本研究拟执行以下四部分,第一部分,评价超声光散射断层成像预测BC腋窝淋巴结转移的效能。第二部分,评估SPP1与TTHC的相关性及其在BC腋窝淋巴结转移中预测效能。第三部分,体外实验探究SPP1通过PI3K/AKT信号通路调控BC细胞的生物学行为。第四部分:通过生物信息学分析预测SPP1上游调控分子,通过细胞实验和裸鼠皮下成瘤实验探究mi R-127-5p靶向SPP1通过PI3K/AKT通路调控BC细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。研究方法:1、评价超声DOT测得病灶总血红蛋白浓度在BC腋窝淋巴结转移中的预测效能连续纳入2012年3月至2012年7月,在我院行BC手术且符合入选标准的T1期患者,术前应用超声DOT评估病灶最大血红蛋白浓度（TTHC）。以术后病理诊断淋巴结转移为金标准,绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析TTHC的预测效能。术后定期随访,记录患者首次确诊复发或转移时间,随访截止于2022年1月30日。应用ROC分析TTHC在BC远期复发转移中的预测价值。2、通过生物信息学分析筛选出与BC上皮间质转化（EMT）相关的差异基因SPP1,通过western blot和荧光定量PCR检测SPP1在BC和癌旁组织中的表达。通过免疫组化检测SPP1蛋白在BC组织中表达,分析BC患者SPP1的表达与临床病理信息的相关性。分析BC中TTHC、SPP1和Ki-67表达的相关性。采用Logistic回归分析BC腋窝淋巴结转移的影响因素;将乳腺癌功能代谢指标TTHC、经典预后指标Ki-67以及新预测因子SPP1相结合,构建一个新的预测模型Pre。应用Z检验比较TTHC、Ki-67、SPP1及Pre预测BC淋巴结转移的价值。3、选取SPP1表达量相对较高的BC细胞系MDA-MB-231和SK-BR-3,利用慢病毒干扰载体构建SPP1稳定敲减的细胞系。通过CCK8实验、划痕实验和transwell实验检测敲减SPP1表达后,BC细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。通过western blot检测敲减SPP1表达后,BC细胞中PI3K/AKT信号通路关键蛋白的变化,探究SPP1影响BC生物学行为的机制。4、通过Targetscan,mi Rnet预测SPP1上游的mi RNA为mi R-127-5p,通过荧光定量PCR检测mi R-127-5p在BC组织和细胞系中的表达,分析其与SPP1的共表达关系。通过双荧光素酶实验验证mi R-127-5p和SPP1的直接结合作用。BC细胞分四个处理组:对照组NC、agomi R-127组、antagomi R-127组及作为回复实验的antagomi R-127+sh-SPP1组。通过CCK8实验、划痕实验和transwell实验检测mi R-127-5p靶向SPP1对BC细胞生物学行为的影响。Western blot检测PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。建立BALB/c裸鼠皮下成瘤模型,验证mi R-127-5p/SPP1在体内的作用。结果:1、淋巴结转移（+）组TTHC值显著高于淋巴结转移（-）组:230.74±66.21μmol/L vs 188.65±67.74μmol/L（P＜0.05）。以术后病理诊断淋巴结转移为金标准,TTHC在预测淋巴结转移中AUC为0.710（95%CI:0.605-0.815;P＜0.05）,显示了较好的预测效能。根据ROC曲线取TTHC＞185.75μmol/L作为预测T1期BC腋窝淋巴结转移的最佳阈值,敏感度83.0%、特异度71.4%。在术后远期复发转移组和非复发转移组,TTHC值分别为:251.46±68.12μmol/L和199.62±65.94μmol/L（P＜0.05）。以术后远期复发或转移为金标准,绘制ROC曲线,AUC为0.724（95%CI:0.582-0.866;P＜0.05）,取TTHC＞184.62μmol/L作为预测T1期BC术后远期复发/转移的最佳阈值,敏感度92.3%、特异度50.7%。2、生物信息学分析显示SPP1在BC患者中高表达,且与不良预后相关。Western blot和荧光定量PCR显示,SPP1在BC组织中的表达量高于癌旁组织。免疫组化结果显示,SPP1和Ki-67在淋巴结转移组的表达高于非转移组。相关性分析结果表明,术前超声DOT评估的BC的TTHC与术后病理标本中的SPP1蛋白表达正相关:rs=0.506（P＜0.05）。单因素和多因素Logistic回归分析显示Ki-67和SPP1是BC淋巴结转移的独立危险因素。ROC分析显示,SPP1、Ki-67、TTHC及Pre在预测T1期BC淋巴结转移中（AUC=0.703、0.675、0.710、0.803）均显示了较好的效能。Z检验显示新预测模型Pre和其他指标之间的最大AUCs差异显著（P＜0.05）,表明Pre比其他单一参数具有更好的预测效能。3、通过慢病毒干扰载体敲减SPP1的表达,探究SPP1在BC进展中的作用和潜在机制。细胞增殖实验显示:敲减SPPl后,SK-BR-3和MDA-MB-231细胞生长速度较对照组明显减慢（P＜0.05）;划痕实验显示:敲减SPPl后,24小时后细胞的迁移距离较对照组明显下降（P＜0.05）;Transwell实验显示:敲减SPPl后,24小时后穿膜细胞数较对照组明显减少（P＜0.05）;说明SPP1可以抑制BC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Western blot实验结果显示:敲减SPPl后,p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著减少（P＜0.05）。提示SPP1可能通过增加磷酸化的PI3K和AKT水平,促进BC细胞的进展。4、荧光定量PCR实验显示BC组织中mi R-127-5p表达水平较正常组织显著减低（P＜0.05）,且与SPP1表达呈负相关。双荧光素酶实验验证mi R-127-5p和SPP1之间可以直接结合。CCK-8实验、划痕实验和transwell实验显示,antagomi R-127组细胞增殖活性、迁移和侵袭能力最强,agomi R-127组细胞增殖活性、迁移和侵袭能力最弱（P＜0.05）。在回复实验antagomi R-127+sh-SPP1组,敲减SPP1可以部分回复antagomi R-127对BC细胞增殖和迁移侵袭能力的促进作用。Western blot检测PI3K/AKT通路相关蛋白结果显示:分别转染agomi R-127和antagomi R-127后,p-PI3K和p-AKT蛋白的表达量会显著减少和增加。在回复实验antagomi R-127+sh-SPP1组,敲减SPP1可以部分逆转antagomi R-127的促进作用。研究结果表明,mi R-127-5p靶向SPP1可通过PI3K/AKT通路调控BC的增殖、迁移和侵袭。通过构建裸鼠皮下成瘤模型,评估四组肿瘤体积和重量的差异。结果表明,分别转染antagomi R-127和agomi R-127后,肿瘤体积和重量明显增加和减少（P＜0.05）。转染antagomi R-127可部分逆转敲减SPP1对肿瘤体积和重量的抑制作用。结果提示mi R-127-5p直接靶向SPP1调控乳腺癌细胞MDA-MB-231的成瘤能力。结论:1、首先,在预测T1期BC淋巴结转移中,影像指标TTHC,新预测因子SPP1和传统预测因子Ki-67具有良好和相似的预测能力。其次,本研究首次将BC影像指标（TTHC）和病理学指标（Ki-67和SPP1）相结合,得到全新预测模型Pre,可较单一指标更为有效的预测T1期BC术前淋巴结转移风险,以避免不必要的ALND,减少术后并发症。2、本研究从分子生物学角度探究BC发生转移的机制。SPP1通过PI3K/AKT通路促进BC的增殖、迁移和侵袭。Mi R-127-5p靶向SPP1通过PI3K/AKT通路调控BC进展。最后,敲减SPP1部分回复了antagomi R-127在BC增殖侵袭中的促进作用。这些发现表明mi R-127-5p/SPP1参与BC的增殖、迁移和侵袭,可能是潜在的生物标志物,辅助诊断治疗。