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番茄(Tomato)属于中度逆境敏感型和加工型蔬菜,其容易受到低温、弱光、土壤盐渍化等一些逆境的影响,而这些都会导致番茄植物体内产生一些有毒害作用的活性氧物质,如羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)等。而叶绿体抗坏血酸过氧化物酶(chlAPX)对保护植物叶绿体和其它细胞不受H2O2和·OH的破坏作用是必须的。许多研究已经证明叶绿体APXs在植物逆境光保护中发挥着关键作用,过量表达APX基因的转基因植物可以提高植物对于氧化胁迫的耐受性,其中,LetAPX是番茄类囊体膜结合型的APX。但对于APX转基因的反义表达,并未有太多研究,本文主要是对LetAPX基因反向插入到番茄基因组中得到的基因修饰番茄进行研究,讨论反义LetAPX基因修饰番茄在无逆境胁迫、盐胁迫等生长条件下,番茄植株APX酶活性变化情况、植物生长状态、对番茄果实基本营养合成的影响、基因修饰番茄果实食用安全性等问题。为基因修饰及转基因番茄进一步应用研究工作提供重要理论信息。 论文的主要研究内容和结论如下: (1)研究在正常种植条件下,反义LetAPX基因修饰番茄和非基因修饰番茄植株生长情况有无明显差别,反义LetAPX基因转基因植株的基因插入及表达情况。通过随时观察并记录番茄植株的生长情况,并对反义LetAPX基因进行验证。结果表明反义LetAPX基因修饰番茄植株和非基因修饰番茄植株生长速度及一般生理情况并无明显差异。反义LetAPX基因在番茄根、茎、花、叶、果中都能正常表达,其中叶片表达最多。 (2)研究在正常种植条件下,LetAPX基因的反向插入在番茄植株抗氧化酶系统中所起的作用,对番茄叶片和果实中的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)酶活性有何影响。通过测定番茄植株苗期、花期、果期中叶片APX、SOD、POD、CAT酶活性,结果表明反义LetAPX基因修饰番茄叶片中APX酶活性在苗期、果期均低于非基因修饰番茄植株,而在花期却高于非基因修饰番茄植株。SOD酶活性在苗期、花期略低于非基因修饰番茄植株,在果期高于非基因修饰番茄植株。POD酶活性在苗期、花期略高于非基因修饰番茄植株,在果期低于非基因修饰番茄植株。CAT酶活性在苗期低于非基因修饰番茄植株,在花期高于非基因修饰番茄植株,在果期与非基因修饰番茄植株基本相同。对番茄果实中抗氧化酶的测定发现,反义LetAPX基因修饰番茄果实中APX酶活性比非基因修饰番茄果实要低,POD酶活性明显低于非基因修饰番茄果实,SOD、CAT酶活性则相差不大。研究结论如下:在番茄正常种植条件下,LetAPX基因反向插入确实可以抑制APX表达,降低其酶活性,但APX酶活性的降低同时影响着植物体内抗氧化酶系统,使得SOD、POD、CAT等酶活性都发生了相应改变。而随着活性氧的累积可能又刺激植物抗氧化酶系统防御性提高,使得APX酶活性升高,清除过多的的活性氧,保持植株体内自由基产生和清除的平衡。 (3)研究反义LetAPX基因的表达对番茄果实基本营养元素含量有何影响,测定结果表明LetAPX基因反向插入到番茄植株中可以提高其果实维生素C含量,但由于LetAPX基因在果实中表达较少,因而对番茄其它营养成分影响较小。反义LetAPX基因修饰番茄果实中的糖、酸、蛋白、维生素E、番茄红素含量比非基因修饰番茄果实略低。 (4)对反义LetAPX基因修饰番茄食用安全性进行评价,对实验动物进行连续90天灌胃不同浓度的反义LetAPX基因修饰番茄,观察并记录实验动物的体重增长情况及生长情况。灌胃结束后,检查实验动物的血常规、血生化指标,并对实验动物进行解剖,取实验动物的主要器官进行病理组织学观察。实验发现,各浓度剂量组的实验动物均无突然死亡事件,实验动物的一般生长情况、血常规指标、血生化指标、器官系数、组织病理学检查与非基因修饰组和蒸馏水对照组相比均无明显差异(P>0.5),结果说明反义LetAPX基因修饰番茄对小鼠的正常生长、发育并无明显不良影响,初步研究证明反义LetAPX基因修饰番茄是安全的,可食用的。