论文部分内容阅读
胰高血糖素样肽-2(Glucagon-like peptide-2,GLP-2)来源于肠内分泌L细胞,由胰高血糖素原(Proglucagon,PG)基因转录和翻译加工而成。研究表明GLP-2具有增强肠道屏障功能、增加血流量和隐窝-绒毛高度以及促进隐窝细胞存活等功能,并对短肠综合症(Short bowel syndrome,SBS)患者具有显著的疗效。但GLP-2对肠损伤疾病的治疗效果及作用机制仍有待进一步研究。目前,临床研究中使用的GLP-2均通过化学方法合成,其制备流程复杂、周期长、成本高且半衰期较短。这些因素大大限制了GLP-2在临床研究中的广泛应用。因此,研发能够高效制备并具有较长半衰期的GLP-2类似物,研究其在肠损伤疾病中的治疗作用及机制,具有重要的临床价值。我们课题组在优化GLP-2结构的基础上利用基因工程技术设计并制备了一种新的GLP-2二聚体类似物,命名为GLP-2(2),并已获得国家发明专利授权(CN103159848A);通过对GLP-2(2)的生物活性进行测定,结果显示:(1)CCK-8实验表明,GLP-2(2)具有与化学合成的GLP-2单体类似的促增殖作用;(2)体内动物实验及HE染色分析发现GLP-2(2)和GLP-2均可以促进正常小鼠小肠重量、长度及绒毛高度的增加;(3)通过体内注射BrdU,用其特异性抗体标记,显微镜分析发现GLP-2(2)和GLP-2均可以显著促进肠道细胞的增殖,且GLP-2(2)作用始终优于GLP-2单体。上述研究结果提示,重组GLP-2(2)不但具有肠道保护作用,而且其作用优于化学合成的GLP-2单体。而对于病理状态下的肠道损伤,GLP-2(2)是否还具有优于单体的治疗效果?GLP-2(2)优于单体治疗效果的机制是什么?还尚不清楚。为此,我们进行了以下研究:首先,为了将GLP-2(2)开发为一种潜在的治疗肠损伤疾病的新型和安全的基因工程药物,按照《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》的要求,我们拟完善GLP-2(2)的药学研究,包括建立GLP-2(2)生产种子库,对其进行全检,并对工程菌的遗传稳定性进行评价;建立GLP-2(2)的发酵和纯化工艺,并进行放大验证;同时,建立GLP-2(2)的质量检定方法,确保样品的稳定性、有效性和批次之间的一致性,为临床前药效学、安全评价等实验研究提供合格的样品,保障临床前研究的顺利进行,奠定GLP-2成为治疗肠损伤疾病潜在药物的基础。其次,通过体内外放射性肠病模型和炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)模型的构建,拟系统研究GLP-2(2)对放射性肠病和IBD的治疗作用;最后,通过研究GLP-2(2)的药代动力学特性、体内外稳定性、受体激活能力以及对细胞增殖和凋亡相关信号通路的激活情况,进而阐明GLP-2(2)优于单体治疗效果的机制。通过以上研究我们获得了如下结果:(1)建立了GLP-2(2)的生产种子库,全检合格,且菌种表现出良好的遗传稳定性;建立了GLP-2(2)的中试发酵工艺,将发酵规模放大到30L,每升发酵液可得到的菌体量始终大于30g;建立了GLP-2(2)的中试纯化工艺,三批可得到纯度大于95%(HPLC归一化法)的GLP-2(2)原料3.56g,可制200μg/支的冻干粉针剂15000支;初步建立了GLP-2(2)的质量检定方法,如CCK-8测定GLP-2(2)生物活性法,HPLC测定纯度法,DNA探针杂交测定外源性DNA残留量法以及酶联免疫吸附测定宿主蛋白残留量法等,并进行了测定,所有项目均符合重组DNA制品质量检定规程的要求。(2)放射性肠病细胞模型和动物模型显示,GLP-2(2)可以显著减少辐射诱导的人结肠成纤维细胞(CCD-18Co)的凋亡、坏死和G0/G1期细胞周期停滞;GLP-2和GLP-2(2)均可以保护小鼠免受辐射诱导的胃肠道毒性,下调辐射诱导的炎症反应,减少肠道的结构性损伤,促进肠道内隐窝细胞的增殖以及减少辐射诱导肠道细胞的凋亡,且GLP-2(2)的作用优于GLP-2单体。(3)IBD细胞模型和动物模型显示,GLP-2(2)可以显著降低LPS诱导的CCD-18CO炎性因子的分泌,减少CCD-18Co细胞的凋亡;GLP-2和GLP-2(2)均可缓解葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium salt,DSS)诱导的结肠炎,下调DSS引起的炎症反应,调节结肠细胞的增殖和凋亡,且GLP-2(2)的作用优于GLP-2单体。(4)初步的药代动力学结果和cAMP分析显示,与GLP-2单体相比,GLP-2(2)表现出更长的半衰期、更强的体内外稳定性和受体激活能力。(5)GLP-2(2)增强了辐照诱导CCD-18Co细胞中Akt、Gsk-3β和Erk1/2的磷酸化,通过激活PI3K-Akt和MEK-Erk信号通路保护CCD-18Co细胞,且GLP-2(2)激活通路的能力强于GLP-2单体。(6)GLP-2(2)通过抑制Caspase-3活化而抑制Bcl-2的降解,从而促进细胞的存活,且GLP-2(2)作用强于GLP-2单体。综上所述,通过本课题的研究我们初步完善了GLP-2(2)的药学研究;证实了GLP-2(2)对放射性肠病和IBD具有显著的治疗效果,且GLP-2(2)的治疗效果优于GLP-2单体;初步的药代动力学结果和cAMP分析结果显示GLP-2(2)具有更长的半衰期、更强的体内外稳定性和受体激活能力;信号通路研究发现GLP-2(2)能够参与细胞增殖和凋亡相关的多条信号通路,并通过上述通路表现出优于单体的能力。