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铅是一种广泛分布的环境重金属毒物,具有显著的神经毒性,可以引起儿童学习记忆能力减弱和认知功能障碍等。近年研究发现,血铅浓度作为铅中毒的生物标志物并不能完全评价铅的神经毒性效应,然而,这是否与铅在大脑中的特殊分布以及蓄积有关,目前相关的报道甚少,因此,研究铅在大脑中的分布对于阐明铅神经毒性作用机制具有重要的意义。突触可塑性是学习记忆形成的神经生物学基础,包括功能可塑性和结构可塑性,以往铅损伤学习记忆功能的研究多集中于突触的功能可塑性,然而功能可塑性的改变并不能完全解释铅的神经毒性机制。突触的结构可塑性是功能可塑性的基础,因此,研究铅暴露后突触结构可塑性的改变及其分子调控机制,对于阐明铅损伤学习记忆功能的机制是一个新的突破口。树突棘可塑性是突触结构可塑性的重要组成部分,包括树突棘密度和形态的变化。树突棘作为兴奋性突触的突触后膜,其数量和形态的变化对兴奋性突触传递具有显著的影响,与学习记忆功能密切相关。Neuroligin1(NLGN1)是位于兴奋性突触后膜上的突触黏附分子,调控兴奋性突触的形成与形态。因此,研究铅暴露是否通过影响NLGN1的功能导致树突棘可塑性损伤进而引起学习记忆功能障碍有可能为进一步阐明铅损伤学习记忆功能的机制提供新的线索。综上,本课题集中研究了铅在大脑内的分布及其对树突棘可塑性影响,并初步探讨了NLGN1在其中的作用。目的:本研究通过建立铅暴露大鼠模型和原代培养大鼠海马神经元铅暴露模型,综合应用形态学、分子生物学及功能学评价等技术手段,观察铅在大脑内的分布,研究铅的蓄积对树突棘可塑性的影响,并进一步探讨NLGN1在其中的作用。研究结果将有助于进一步阐明铅损伤学习记忆功能的分子机制,为探索潜在药物治疗靶点提供新的理论依据。方法:1.建立模型1)动物模型:孕期铅暴露大鼠模型,分为对照组、铅暴露组,通过饮水染毒,剂量为0、0.005%、0.01%和0.02%的醋酸铅,在P10(postnatal day)结束铅暴露,将P30雄性大鼠作为研究对象。2)细胞模型:原代培养大鼠海马神经元铅暴露模型,铅暴露浓度为0、0.1、1μmol/L的醋酸铅,在DIV7(days in vitro)进行铅暴露,持续5 d,于DIV12进行观察。2.利用原子吸收分光光度法检测铅在血液和大脑中的含量。3.采用AMG(Autometallography)和XFM(X-ray flurescence microspectroscopy)检测铅在大脑中的分布。4.采用全细胞膜片钳记录检测铅对大鼠海马LTP的影响。5.通过尼氏染色观察铅暴露对大鼠海马CA1区神经元数量的影响;Golgi染色结合Imaris软件观察铅暴露对大鼠海马CA1区神经元树突发育和树突棘的影响。6.采用MTT法测定铅对原代培养海马神经元存活的影响,筛选合适的铅暴露浓度。7.利用免疫印迹法(Western Blot)观察铅暴露对大鼠海马组织和原代培养大鼠海马神经元中NLGN1、PSD-95和NR-2A蛋白表达的影响。8.通过免疫荧光染色法观察铅暴露对原代培养大鼠海马神经元树突棘的影响。结果:1.铅在大鼠大脑内的分布1)检测子代大鼠血铅浓度发现,与对照组相比,铅暴露组大鼠在P0、3、7、10和21各时间点血铅水平均显著升高;而在P30,铅暴露大鼠血铅水平与对照组相比无显著差异。2)AMG结果显示,与对照组相比,P10和P30铅暴露组大鼠大脑中铅的蓄积均明显增加,其中以海马最为显著。3)原子吸收分光光度法结果显示,与对照组相比,P10和P30铅暴露大鼠海马组织铅含量显著升高。4)XFM实验结果表明,与对照组相比,铅暴露组大鼠大脑中铅的含量显著增多,且主要蓄积于海马内。2.铅暴露对大鼠海马神经元树突棘可塑性的影响1)通过高频刺激诱导大鼠海马LTP发现,与对照组相比,铅暴露组EPSC的增加幅度显著减小。2)铅暴露后海马CA1区神经元密度、神经元树突分支数量无显著变化,而神经元树突棘密度显著降低,其中thin、filopodium和mushroom形态的树突棘数量均显著减少。3)免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,铅暴露组原代培养海马神经元树突棘密度显著降低。3.铅暴露对NLGN1、PSD-95和NR-2A蛋白表达的影响1)Western Blot结果表明,与对照组相比,铅暴露组大鼠海马组织中NLGN1、PSD-95和NR-2A蛋白表达水平均显著降低。2)Western Blot结果显示,与对照相比,铅暴露组原代培养海马神经元的NLGN1、PSD-95和NR-2A蛋白表达量均显著减少。结论:1.铅暴露后大鼠大脑中铅含量显著增加,且呈不均匀分布,其中海马为铅主要蓄积的部位。2.铅暴露导致大鼠海马LTP受损,表明神经元突触功能可塑性损伤。3.铅暴露导致大鼠海马CA1区神经元树突棘密度降低,且thin、filopodium和mushroom形态的树突棘数量减少,表明神经元突触结构可塑性受损。4.铅暴露导致海马神经元NLGN1、PSD-95和NR-2A的蛋白表达水平显著降低,从而影响树突棘的形成、发育和成熟。