目的:通过对单链特异性核酸酶CEL I特异性识别水解单碱基错配能力及特点的研究,以及对滚环扩增技术（RCA）中环形模板、引物及荧光指示剂的筛选与优化,建立一种基于CEL I的RCA高特异性mi RNA检测技术体系,并通过与现有检测技术的对比研究评价其应用潜能,为满足POC需求的低成本、高特异性、高敏感性的检测设备提供技术策略。研究方法:本研究首先使用人工合成长度为30bp的含有不同种类单碱基错配的寡核酸双链考察CEL I识别水解含有单碱基错配的能力与特点,构建CEL I催化的探针-引物保护体系;在RCA体系中,设计制备可以特异性与引物杂交的环形模板序列,并在环化反应后利用核酸外切酶去除连接序列及未环化的模板序列;利用人工合成的与let-7a mi RNA序列相同的let-7a DNA寡核酸单链及互补的let-7a DNA/clet-7a核酸双链分别作为RCA引物,通过对比研究核酸单链与互补双链分别作为RCA引物时的扩增结果,考察双链引物RCA技术的特点,建立双链引物RCA技术。再将二者结合建立一种基于CEL I的RCA高特异性核酸检测体系（CEL I-RCA）,将let-7a DNA作为检测目标和与之仅有1个碱基差异的let-7e DNA作为干扰序列,利用CEL I-RCA体系对其进行模拟检测,考察其检测特异性;并进一步通过不同浓度目标核酸建立参考系对目标核酸进行相对定量的盲测实验,评价该体系的定量检测性能。为了优化RCA体系的荧光表现及其稳定性,进一步研究不同核苷酸组成的环形模板对RCA荧光结果的影响。通过设计一系列不同核苷酸组合的寡核酸链制备环形模板,利用SYBR Green II（SG II）作为荧光指示剂,对比研究不同环形模板的RCA荧光曲线。并利用人工合成的不同核苷酸组成的寡核酸链考察SG II的核苷酸偏好。再通过对比SG II和SYBR Green I（SG I）两种荧光指示剂在RCA反应中的荧光曲线,分析由不同核苷酸组成的环形模板所得扩增产物的潜在二级结构,优化RCA环形模板序列。通过人工合成的let-7家族mi RNA（let-7a-let-7f）及其c DNA考察CEL I水解含有错配碱基的DNA/RNA杂交双链的能力,优化反应体系,使之可以用于mi RNA的直接检测。最后,通过对比研究该检测技术与Taqman探针法RT-q PCR技术检测let-7家族mi RNA的结果,评价二者在检测特异性和分辨率上的差异,评估基于CEL I的RCA高特异性核酸检测体系在POC检测设备中的应用潜力。结果:CEL I在特定条件下（浓度、温度、反应时间）可以水解含有错配碱基的DNA双链,而保留与DNA探针完全互补的目标核酸链;完全互补的寡核酸双链可以作为RCA反应的引物,与寡合酸单链作为引物相比,其扩增曲线具有相同的浓度依赖性。二者结合构建的CEL I-RCA高特异性核酸检测体系可以特异性检测仅有一个碱基差异的DNA寡核酸链。通过标准浓度样品的参照可以对目标DNA寡核酸链进行相对定量检测。针对RCA体系中荧光指示剂SG II的研究结果显示,SG II只与鸟嘌呤核苷酸产生较强的荧光信号,与其他三种核苷酸产生的荧光较弱。含有大量AC核苷酸的环形模板可以在以SG II为荧光指示剂的RCA反应中表现出线性增加的荧光信号;含有大量TC核苷酸的环形模板则会在以SG I为荧光指示剂的RCA反应中表现出线性增加的荧光信号。富AG核酸链具有潜在的类双链结构可以与SG I产生较强的荧光。进一步研究CEL I-RCA体系直接检测mi RNA的能力,结果证实CEL I可以水解由let-7家族mi RNA与DNA探针杂交形成的含有错配碱基的DNA/RNA双链;通过在CEL I酶切反应后对其高温灭活可以消除由CEL I引起的非特异性扩增。针对let-7家族mi RNA的模拟检测结果表明,CEL I-RCA核酸检测体系可以高分辨检测let-7家族成员,其排除干扰mi RNA所引起的非特异性扩增的能力优于Taqman探针法RT-PCR。结论:（1）CEL I不仅可以水解核酸单链,还可以完全水解含有单碱基错配的DNA/DNA或DNA/RNA寡核酸双链,将单碱基的差异转化为核酸链有无的差异,提高核酸检测的特异性;（2）完全互补的寡核酸双链也可以作为RCA引物,其扩增曲线具有良好的浓度依赖性;（3）RCA荧光指示剂SYBR Green II具有明显的核苷酸偏好,其只与鸟嘌呤产生较强的荧光信号;（4）利用SYBR Green II作为核酸染料时,富AC核苷酸组合的RCA模板具有更稳定的线性荧光曲线;（5）CEL I-RCA高特异性核酸检测体系可以区分仅有一个碱基差异的核酸链,通过该方法不仅可以进行核酸样品的相对定量检测,而且其检测特异性优于RT-PCR。