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丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)引起的传染性疾病,主要通过血源途径传播,以慢性化程度高为主要特征。全球范围内HCV感染者为1.7～2.0亿,我国大约为4000万。HCV感染后有75～85%的感染者会形成慢性肝炎,进一步会发展为肝硬化和肝癌,目前HCV感染已成为严重危害人类健康的全球公共卫生问题之一。迄今为止抗HCV的治疗仅限于干扰素-利巴韦林联合使用,只有约50%的患者可获得持续的抗病毒反应,而且费用昂贵、有一定毒副作用,因此迫切需要研制更加安全有效的新型抗病毒药物和生物制品。HCV NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),在病毒RNA复制中起着关键作用,而细胞中则没有相应功能的酶类,因此NS5B蛋白是抗HCV的理想靶位。近年来很多学者针对NS5B蛋白设计了多种核苷类与非核苷类抑制剂,疗效显著,然而临床试验发现用药后易出现耐药突变株,影响了抑制剂的进一步应用。鉴于NS5B蛋白晶体结构已经明确,它在复制基因组RNA中需要一定的空间构型转换才能发挥酶催化活性,可以克服抑制剂的耐药现象,因此构型抑制剂研究已成为拮抗NS5B酶活性研究的又一重要方向。单链抗体(ScFv)基因通过载体携带进入靶细胞内与与抗原特异结合,调节靶分子构型转换与细胞内定位,影响其生物功能的发挥,可将病毒复制的关键分子选择性的“敲除”,从而达到使目标分子生物学功能失活的目的。本研究从构建的核糖体展示人单链抗体库中,筛选出了抗NS5B蛋白的人源化单链抗体,有可能抑制NS5B蛋白的空间构型转换,为进一步研制抗HCV生物制剂带来了新的希望。【目的】以在HCV RNA复制中起关键作用的RNA聚合酶NS5B蛋白为靶标,从HCV阳性患者的PBLs中提取mRNA并构建ScFv基因文库,利用完全体外筛选、高库容的核糖体展示技术来筛选针对NS5B蛋白的人源性ScFv,将初步鉴定筛选到的ScFv生物学功能。【方法】1.运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA;将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,用IPTG诱导表达及可溶性分析;Western-blot检测NS5B蛋白的抗原性和特异性;用Ni2+-NTA亲和层析柱和电洗脱方法纯化NS5B蛋白;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多抗血清。2.从6名HCV阳性患者的外周血淋巴细胞(PBLs)中提取总RNA,甲醛变性电泳检测RNA质量;以反转录的全长cDNA为模板PCR扩增全套重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因,将VH和VL的胶回收产物拼接,来构建核糖体展示的人单链抗体(ScFv)基因库;构建ScFv-pMD18T载体,转化后挑60个克隆提取质粒,将酶切鉴定正确的31个克隆送去测序。3.将纯化的NS5B蛋白包被磁珠;ScFv DNA库在兔网织红细胞裂解液中进行体外转录与翻译,形成ScFv-核糖体-mRNA(ARM)三聚体;用包被抗原从三聚体中筛选抗NS5B的ARM;筛选得到的ARM用Trizol试剂提取RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物进入下一轮循环;经三轮循环,从ScFv库中筛选抗NS5B的特异性ScFv基因并对其测序。4.运用软件设计引物,以测序正确的Anti-NS5B-ScFv-pMD18T重组质粒为模板PCR扩增Anti-NS5B-ScFv基因;克隆入原核表达载体pET16b;将重组表达质粒Anti-NS5B-ScFv-pET16b转化BL21感受态细胞,用IPTG进行诱导原核表达及可溶性分析,SDS-PAGE和Western-blot鉴定ScFv是否有表达。【结果】1.截断型HCVns5b基因克隆、表达及纯化酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性均良好;利用亲和层析和电洗脱方法获得了纯化的NS5B蛋白;制备了效价为1:3000的抗血清。2.核糖体展示人ScFv库的构建从6名HCV阳性患者的PBLs中提取总RNA,甲醛变性电泳结果可见28s和18s rRNA条带,表明RNA的质量很好;通过重叠PCR技术扩增抗体的VH和VL基因,并用linker将其拼接,成功构建了ScFv DNA文库;对31个阳性克隆进行序列分析,结果表明该文库有很好的多样性,库容量较大,约为7.86×1012。3.筛选针对NS5B的ScFv将ScFv DNA库体外转录和翻译,通过SDS-PAGE证实其有效形成了ScFv-核糖体-mRNA三聚体;用包被抗原从三聚体中筛选获得了针对NS5B的ScFv基因并测序正确。4.抗NS5B ScFv的原核表达及初步鉴定成功构建了ScFv-pET16b重组表达质粒,并转化E.coli BL21进行原核表达,经SDS-PAGE分析,在大小约为27kD处有新生表达条带, Western-blot进一步证明了ScFv的特异性。【结论】运用核糖体展示技术构建人源性ScFv文库,以HCV NS5B蛋白为靶标筛选到了其ScFv,本实验将为利用人单链抗体治疗HCV研究提供了实验基础。