研究背景和目的:肿瘤转移是恶性肿瘤患者最主要的致死原因,大约有90%的癌症患者死亡是肿瘤转移所致。肝脏是肿瘤转移最主要的靶器官之一。转移性肝癌（肿瘤肝转移）发病率逐年上升,起病隐匿,且预后不良。因此深入研究转移性肝癌的发生发展机制,寻找潜在的防治靶点,对于保障人民生命健康有重要意义。性别是影响肿瘤发生发展、治疗反应性及预后的关键因素。对大多数非性别特异性肿瘤而言,男性的发病率及死亡率都要高于女性患者,但引起这种差异的机制还不明确。很多研究揭示了性别因素对肿瘤细胞本身的影响,但具体的结论尚存争议。同时,性别因素对肿瘤微环境的影响尚少见报道。与肿瘤发生的性别差异现象获得的大量关注不同,关于肿瘤转移尤其是肝转移的性别差异的研究相对较少,转移性肝癌的性别差异还需进一步的研究证实,性别因素对肿瘤肝转移的“土壤”—肝脏微环境的影响还不清楚。肿瘤肝转移是一个复杂的且低效的过程。大量研究证实,循环肿瘤细胞在进入肝脏后与肝脏微环境的各种成分相互作用是转移成功与否的关键。肝脏微环境中的实质细胞、免疫细胞、肝星状细胞等都参与了针对肿瘤细胞的反应,在肝转移的不同阶段或促进或抑制肿瘤转移的进程。在这一过程中,免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用对肿瘤肝转移的关键。很多研究发现性激素可以通过其相应的受体直接影响免疫细胞的分化和功能。因此性激素可能通过影响肝脏微环境中的免疫细胞的功能进而影响肿瘤肝转移,但该假说需进一步验证,相关机制需进一步研究。中性粒细胞是机体对抗外源性病原体入侵的第一道防线,并在肿瘤转移过程中具有重要作用。它参与了肿瘤转移的多个阶段,如抑制NK细胞对循环肿瘤细胞的杀伤、促进穿出血管及促血管新生等,清除中性粒细胞可明显抑制肿瘤转移。既往研究发现中性粒细胞的发育受到雄激素/雄激素受体信号通路的调控。但具体的调控机制及这种调控对转移性肝癌性别差异的影响尚需进一步研究。本课题综合利用患者的临床资料、实验性肝转移模型及分子生物学等方法深入研究了转移性肝癌的性别差异,并探讨了引起这种性别差异的分子机制。本研究不仅有利于阐明转移性肝癌发生发展的新机制,为临床防治提供潜在的靶点,更重要的是,本研究还可为转移性肝癌患者的按性别施治的治疗策略提供依据,从而为基础研究成果走向应用提供理论基础。方法:1.通过SEER数据库获取多种常见肿瘤患者的临床资料,分析男性和女性癌症患者出现肝转移的比例和性别对转移性肝癌患者总生存期的影响。2.经脾接种肿瘤细胞建立实验性肝转移动物模型,分析性别对实验性肝转移的影响。3.建立皮下荷瘤和肺转移动物模型,比较其他部位肿瘤生长是否存在性别差异。4.通过对雄鼠和雌鼠去势初步探究何种性激素对肿瘤肝转移产生影响;再对去势雄鼠补充雄性激素初步明确雄性激素对肿瘤肝转移的影响;利用雄性激素受体（AR）敲除小鼠建立肝转移模型进一步明确雄激素通过雄激素/AR受体信号通路影响肿瘤肝转移。5.定量PCR检测不同肿瘤细胞的雄激素受体与雌激素受体的表达量,体外检测雄激素对使用的肿瘤细胞增殖影响,分析雄性激素是否直接作用于肿瘤细胞促进其增殖;免疫组化染色检测肝脏切片的Ki67和皮下瘤CD31表达情况。6.经脾接种CFSE染色后的肿瘤细胞和稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞,通过免疫荧光染色和活体成像,观察肿瘤细胞早期在肝脏滞留情况。7.流式细胞术检测雄鼠、去势雄鼠和雌鼠未荷瘤和荷瘤条件下肝脏内免疫细胞的变化。8.应用免疫缺陷小鼠和免疫细胞中和抗体分别清除雄鼠和雌鼠相应的免疫细胞后,再经脾接种肿瘤细胞来探究雄性激素通过影响何种免疫细胞促进肿瘤肝转移。9.定量PCR检测了肝脏内中性粒细胞募集相关的趋化因子的表达;应用流式细胞术检测荷瘤小鼠肝脏内中性粒细胞的凋亡情况和活性氧簇在中性粒细胞中的含量;血细胞分析仪各批次实验小鼠外周血细胞计数。10.流式细胞仪检测了雄激素对中性粒细胞发育过程中各前体细胞的影响和增殖水平;定量PCR检测在未荷瘤小鼠及荷瘤小鼠的骨髓细胞、骨髓中的中性粒细胞、肝组织中CXCR2和CXCR4表达的影响。结果:1.男性患者出现肝转移的比例高于女性患者,同时男性癌症患者相较女性患者有着更低的总生存期,其中结肠癌、肺癌及胰腺癌出现肝转移的患者中,男性患者的总生存期也明显低于女性患者。2.在肝转移动物模型中,雄鼠肿瘤负荷都要明显高于雌鼠;通过观察肝脏HE切片肝转移灶所占肝脏面积明显高于雌鼠,且与肿瘤生长模式无关。3.雄鼠的皮下肿瘤较雌鼠的生长更为迅速;但是肺转移模型中没有出现差异。4.雄鼠在去势后肿瘤肝转移的负荷明显出现了降低,并且负荷水平与雌鼠接近;去势雄鼠补充雄激素后,肿瘤负荷水平恢复到未去势雄鼠水平;雄性雄激素受体敲除小鼠相较野生型雄鼠经脾接种后肿瘤负荷更低。5.肿瘤细胞雄性激素受体和雌性激素受体的表达水平都很低;CCK8检测添加不同浓度雄激素培养的肿瘤细胞增殖速度未见差异;不同性别小鼠的肝转移灶和皮下瘤增殖指标Ki67的表达未见差异;雄鼠的肿瘤内血管新生程度要高于雌鼠的肿瘤。6.经脾接种24小时后,雄鼠肝内肿瘤细胞滞留于明显多于雌鼠。7.在肝脏未荷瘤和荷瘤的两种情况下,雄性小鼠肝脏内中性粒细胞的比例均明显高于雌鼠和去势雄鼠。8.免疫缺陷鼠和中和抗体清除T细胞C57鼠在经脾接种后肝脏荷瘤水平性别差异依然存在;但清除中性粒细胞后,肿瘤肝转移的性别差异被消除。9.雄激素可明显增加外周血中性粒细胞的数量,同时促进肝脏内中性粒细胞趋化因子的表达从而促进肝脏内中性粒细胞的聚集。10.雄激素能促进中性粒细胞的增殖,但不改变骨髓中中性粒细胞前体比例;同时雄激素能通过抑制骨髓中性粒细胞CXCR4的表达促进中性粒细胞的释放。结论:本研究从临床数据和动物学水平证明了男性明显好发肝转移,并且预后更差。进一步研究显示是通过雄激素/雄激素受体信号通路通过中性粒细胞依赖的方式导致了这种性别差异。雄激素一方面促进了骨髓中性粒细胞的增殖,另一方面通过抑制中性粒细胞CXCR4的表达促进其释放入血及抑制其返回骨髓,导致肝脏内中性粒细胞聚集增加,进而导致了肿瘤细胞在肝内定植增加和血管新生能力增强,最终促进了肿瘤肝转移。在雄鼠中靶向雄激素/雄激素受体信号通路或者清除中性粒细胞可有效抑制肿瘤肝转移。本研究不仅为转移性肝癌的治疗提供了新靶点,并为临床患者按性别施治的临床策略提供了依据。