目的 通过基因克隆技术将转化生长因子β1(transforminggrowthfactor，TGFβ1)抗原基因与乙肝病毒核心抗原(hepatitisBviruscoreantigen，HBcAg)编码基因融合，之后经原核表达制备融合蛋白，并且进一步免疫大鼠研究其免疫原性、免疫学效应，初步探讨其对大鼠肝纤维化的干预作用。 方法 1．构建pThioHisA-HBcAg-TGFβ1重组质粒已插入HBcAgcDNA的质粒pThioHisA在Kpnl酶切位点切开，TGFβ1序列(A、B、C)分别在这个酶切位点之间通过T4连接酶连接，构建重组质粒pThioHisA-HBcAg-TGFβ1(A、B、C)。 2．重组质粒的鉴定分别用E．ColiDH5Q感受态细胞菌转化重组质粒，通过氨苄耐药基因进行蓝白斑筛选，提取阳性克隆菌株，从转化细胞内提取质粒DNA，然后质粒DNA进行PCR鉴定和限制性核酸内切酶Kpnl和Pstl双酶切鉴定。用PCR验证融合基因HBcAg-TGFβ1(A、B、C)时，上游引物按照HBcAgDNA序列设计为公用引物，下游引物按照分别按照HbcAgDNA序列和TGFβ1(A、B、C)序列设计。 3．表达产物分析重组质粒经过细菌转化后，用0．2mg／mlIPTG处理3小时后，然后收集细菌并用高频声波分裂细菌，将所得的蛋白进行SDS-Page电泳，之后凝胶分别用考马斯亮蓝染色和蛋白从凝胶转移至硝基纤维膜进行Westernblot分析。 4．重组蛋白的纯化把从细菌中提取的含融合基因表达产物的上清液，用40％硫酸铵沉淀。沉淀物经0．05mol／LTris-HCl缓冲液冲洗三次，并用该缓冲液悬浮，然后加入蔗糖密度梯度离心管。36000g3小时离心分离，蔗糖溶液从上到下分12层收集，进行SDS-Page电泳，经考马斯蓝染色证明从第5-8层蔗糖溶液收集的蛋白为目的蛋白(图4)，用不含蔗糖的上述缓冲液稀释含目的蛋白的蔗糖溶液，并进行超速离心以去除蔗糖。沉淀(目的蛋白)用缓冲液悬浮，纯化后的蛋白也可低压冻干保存。 5．动物实验：将融合蛋白c作为TGFβ1疫苗免疫SD大鼠，干预大鼠早期肝纤维化，同时设立对照组。动物处死后，留取血清检测ALT、AST、HA、LN以及TGF—βl抗体，并取出数块肝组织，经中性福尔马林固定、石蜡包埋和切片后，分别用于HE染色，Masson染色以及TGFβ1免疫组化染色。 结果 1．通过对重组质粒的PCR鉴定和限制性核酸内切酶Kpnl和Pstl双酶切鉴定证实HBcAg-TGFβl基因融合成功。 2．重组质粒经E．ColiDH5Q菌转化并由IPTG诱导后，收集的表达产物经SDS-PAGE电泳，蛋白条带清晰，而经E．ColiDH5α菌转化后未经IPTG诱导的无目的蛋白条带。 3．重组质粒的原核表达产物经Western-Blot分析表明融合蛋白C的电泳道存在免疫反应的条带．这也证明了它的生物学活性。 4．在动物实验中，融合蛋白C作为TGFβl疫苗免疫SD大鼠，使大鼠自身产生TGFβl抗体。 5．TGFβl疫苗治疗组不仅肝组织的TGFβ1水平明显下降，而且肝功能、肝纤维谱指标及肝脏组织病理均有明显改善。 结论 1．成功构建重组质粒pThioHisA-HBcAg-TGFβ1。 2．成功克隆HBcAg-TGFβ1融合基因。 3．融合蛋白C具有良好的免疫原性。 4．融合蛋白C作为疫苗能干预早期肝纤维化的进展。