中文摘要第一部分胸段食管鳞癌根治术后阴性淋巴结数目与患者预后的相关性分析研究背景食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率以及死亡率分别占全世界恶性肿瘤的第七位和第六位。亚洲以及非洲东、南部地区高发。2015年,我国新诊断食管癌患者47.79万例和食管癌相关死亡患者37.5万例。食管癌的主要病理类型是腺癌和鳞癌,以鳞癌为主,中国患者鳞癌占90%以上。近年来,尽管食管癌在多学科综合治疗方面取得了较大进展,但手术根治切除仍是目前唯一能治愈食管癌的治疗方式。目前研究已证实,淋巴结转移的数目是食管癌患者重要的独立预后因素。而术中淋巴结的清扫程度反映了淋巴结转移数目的准确性,同时一定程度上反映了术后病理分期的准确性。虽然第七版美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)分期系统建议,为了更准确地对食管癌根治术后患者进行分期,至少清扫15个淋巴结,但目前对于食管癌根治术中淋巴结清扫的最佳范围和数目仍存在争议。近年来,阴性淋巴结(negative lymph nodes,NLNs)数目在乳腺癌、胃癌以及结直肠癌中被证实比转移的阳性淋巴结数目更准确的判断患者预后,成为预测患者预后的重要指标。部分研究者分析了 NLNs数目和食管癌患者生存预后的关系,Greenstein等研究发现对于淋巴结阴性的食管腺癌患者,NLNs计数的增加与患者长期生存有关,而对于鳞癌患者,NLNs计数的增加与患者长期生存无关。另一项研究表明,在淋巴结阳性的食管癌患者中,NLNs计数的增加是患者预后的有利因素,而在淋巴结阴性的患者中则未显示NLNs计数与患者预后相关。吴等对429例接受二野淋巴结清扫术的食管癌患者进行了分析研究,结果显示NLNs是淋巴结阴性食管癌患者的独立预后指标。这些研究结果之间存在差异性,结论存在争议。因此,本研究通过对食管癌根治术后胸段鳞癌患者的回顾性分析,探讨NLNs数目与患者预后的相关性,探索NLNs在食管癌术后患者中的临床作用。方法本研究回顾性分析了 2009年1月至2012年12月在山东大学齐鲁医院胸外科接受根治性食管癌切除术的579例胸段食管鳞癌患者。入组标准:患者年龄40～70岁;经组织病理学证实为胸段食管鳞癌;术前未接受过放疗、化疗和/或靶向治疗;无第二原发肿瘤病史;术前检查完善,包括上消化道造影、胸腹部增强计算机体层摄影(computed tomography,CT)、颈部超声、胃镜以及颅脑磁共振(magnetic resonance imaging,MRI);手术完全切除(R0);临床资料完整,至少随访3年或者患者死亡;生存期>3个月。排除标准:非食管癌相关性死亡患者;非R0切除;颈段食管癌;失访患者。根据患者NLNs数目不同,将患者分为4组,分别为0～9、10～14、15～19和≥2 0。随访时间截止到2015年12月30日。采用SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析。对数秩(Log-rank)检验进行单因素分析,Cox回归模型进行多因素分析。单变量分析变量包括年龄、性别、肿瘤长度、肿瘤分化程度、肿瘤位置、T分期、N分期以及NLNs数目。多因素分析包括肿瘤长度、T分期、N分期和NLNs数目。患者生存时间定义为自手术日期到患者随访截止或死亡日期。生存分析采用Kaplan-Meier方法。所有P值双侧检验,P值<0.05表示具有统计学意义。结果1.患者生存情况所有患者均接受了随访,中位随访时间为36个月(3～80个月)。患者中位生存时间(median survival time,MST)36 个月,3 年生存率(overall survival,OS)为 50.8%。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者 3 年 OS 分别为 86.1%、53.7%、31.6%(χ2=67.604,P=0.000)。579例患者中0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为13个月、27个月、39个月和47个月,3年OS分别为21.7%、40.0%、61.2%和77.5%(χ2=120.475,P=:0.000)。淋巴结阴性组患者344例,0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为18个月、36个月、42.5月和48个月,3年 OS 分别为 34.9%、50.9%、65.6%和 89.0%(χ2=35.284,P=0.000)。淋巴结阳性组患者235例,0～9、10～14、15～19和≥20 NLNs组患者的MST分别为12个月、22个月、36个月和45个月,3年OS分别为14.3%、19.3%、51.8%和68.9%(χ2=67.604,P=0.000)。2.患者预后因素分析单因素分析显示,性别(P=0.023)、肿瘤长度(P=0.000)、肿瘤分化程度(P=0.011)、T 分期(P=0.000)、N 分期(P=0.000)以及 NLNs(P=0.000)是影响胸段食管鳞癌术后患者3年总生存率的显著因素。多因素分析显示,肿瘤长度(P=0.042)、T 分期(P=0.000)、N 分期(P=0.000)和 NLNs(P=0.000)是影响胸段食管鳞癌术后患者3年总生存率的显著因素。结论NLNs数目是影响胸段食管鳞癌根治术后患者生存的独立预后指标。建议在控制手术并发症前提下,增加食管癌淋巴结清扫数目,以提高患者的生存。中文摘要第二部分EpCAM在食管癌中的表达以及与免疫治疗相关性研究研究背景食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,对于可手术切除的食管癌,治疗以根治性切除术为主,但局部复发和远处转移是术后患者治疗失败的主要原因。而且约2/3的患者在确诊时已为局部晚期或出现远处转移,失去手术机会,全身化疗联合局部放疗是目前晚期食管癌的主要治疗手段,然而全身化疗后很快出现耐药和治疗失败,患者预后差,总体5年生存率(overall survival,OS)仍保持在15～25%。研究报道食管癌干细胞的存在是肿瘤放化疗抵抗以及治疗失败的主要原因。这部分细胞亚群具有无限增殖、高侵袭性、高致瘤性和多重耐药性等干细胞特性,导致治疗失败。因此,寻找有效的药物针对这部分放化疗抗拒的细胞亚群是治疗食管癌这一致命癌症的关键。上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)目前被认为是重要的癌症生物标志物之一,主要表达在上皮肿瘤中表达,同时也过表达于某些肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),也被认为是某些恶性肿瘤干细胞的标记物。而EpCAM在食管癌干细胞中的表达情况尚不清楚。Solitomab是一种EpCAM/CD3双特异性单链抗体构建体,可同时与表达EpCAM的肿瘤细胞和T细胞相结合,从而激活机体免疫系统的T细胞,起到杀伤肿瘤细胞的目的。研究已经显示Solitomab对结肠癌、胰腺癌以及子宫肉瘤等细胞系有杀伤抑制作用。然而关于Solitomab对食管癌细胞的作用,目前尚未见报道。因此,本研究选取以无血清培养基诱导的食管癌Eca109细胞球为研究对象,分别进行食管癌细胞球的体外增殖、克隆、侵袭性和多药耐药实验以及EpCAM表达水平的检测,并进步观察双特异性抗体Solitomab联合γδT细胞对食管癌细胞球的细胞毒性作用,从而探索有效的食管癌免疫药物。方法1.无血清成球培养法培养Eca109细胞球,镜下和流式细胞仪比较野生型Eca109细胞和Eca109细胞球细胞形态的区别;2.3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-DimethylthiaZOL-2-y1)-2,5-DIPHenyltetrazolium bromide,MTT)法和克隆形成实验检测并比较两组细胞的体外增殖能力;3.Transwell侵袭实验检测并比较两组细胞的侵袭能力;4.MTT法检测并比较两组细胞在纳米白蛋白结合型紫杉醇(Nab-PTX)和顺铂作用后的细胞存活比例;5.流式细胞仪检测EpCAM在两组细胞中的表达水平;6.流式细胞仪检测双特异性抗体Solitomab联合γδT细胞对野生型Eca109细胞和Eca109细胞球的细胞毒性作用。结果1.Eca109细胞在无血清培养基中培养3天后逐渐形成悬浮生长的细胞球,培养至第12天可传代,第2代细胞球形成时间比第1代快,而且体积小,形态规则。流式细胞仪分析可见Eca109细胞球较野生型Eca109细胞的FSC和SSC值偏低,提示Eca109细胞球细胞体积较小,细胞内颗粒较少。2.MTT法和克隆形成实验显示Eca109细胞球细胞的体外细胞增殖率和>50个细胞数的克隆形成率均明显高于野生型Eca109细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Eca109细胞球细胞较野生型Eca109细胞穿过Matrigel基质胶到达滤膜的细胞数多,差异存在统计学意义(P<0.05)。4.MTT法显示不同浓度Nab-PTX和顺铂作用下,Eca109细胞球细胞的存活率均比野生型Eca109细胞高,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.流式细胞仪检测显示野生型Eca109细胞和Eca109细胞球细胞均表达EpCAM,细胞球细胞的表达水平高于野生型Eca109细胞。6.将培养γδ T细胞分别与野生型Eca109细胞以及Eca109细胞球细胞共培养,结果显示不加Solitomab时,γδ T细胞对野生型Eca109细胞或Eca109细胞球细胞的细胞毒作用无明显差别(P>0.05);加入Solitomab后,γδT细胞能够显著增强对二者杀伤的同时,γδ T细胞对Eca109细胞球细胞的毒性作用明显高于野生型Eca109细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.食管癌Eca109细胞球具有较强的增殖、侵袭能力以及多药耐药等干细胞特性,可能含有较高比例的食管癌干细胞;2.食管癌Eca109细胞球高表达EpCAM,EpCAM可能是食管癌干细胞的标志物之一;3.EpCAM可能是潜在的食管癌免疫治疗分子靶点,Solitomab有可能成为化疗抗拒的食管癌免疫治疗的有效药物。