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目的:子痫前期（preeclampsia,PE）是一种以妊娠高血压为特征的疾病。新生儿缺血缺氧性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy,HIE）是PE患者子代常见的临床疾病之一,该病会导致神经退行性变、认知改变、严重智力迟钝、学习和行为问题以及运动障碍等。新生儿HIE涉及血液供氧减少和脑血流量减少,这2个过程会导致胚胎神经元立即死亡（坏死）,或神经元出现细胞延迟死亡（细胞凋亡）,都将造成子代永久性的脑损伤。DNA甲基化在中枢神经系统的发育过程和神经退行性变中,都有着重要作用。胚胎时期的缺血缺氧状态,会导致胚胎脑组织DNA甲基化水平改变。在唐氏综合征中,三拷贝的DNA甲基化转移酶3L（DNA methyltransferase3 like,DNMT3L）可能是引起基因组广泛甲基化原因,而且一些与神经发育相关的基因的表达有所改变;同时,DNA甲基化水平升高可能增加神经元的凋亡,但是这些机制目前并不清楚。所以,在现有的子痫前期胎儿的神经发育的研究基础上,进一步探讨DNMT3L是否会通过DNA甲基化介导的神经元细胞凋亡的分子机制对于我们理解神经发育及退行性疾病的潜在神经病理学至关重要。研究方法:第一部分:子痫前期状态对大鼠胚胎神经元影响的研究将实验用SD雌鼠分Sham组和PE组。在妊娠12.5 d和19.5 d时,将孕鼠放于代谢笼中,收集24 h尿液,检测尿总蛋白量。在妊娠13.5 d时对PE组孕鼠进行开腹缩窄腹主动脉及子宫动脉手术。在妊娠20.5 d,测量孕鼠颈动脉血压;随后开腹取孕鼠的肾脏做HE染色。在妊娠20.5 d,分离子宫取出胎鼠测量体重、脑组织重量。取胎鼠前额叶组织:（1）冰冻切片进行TUNEL染色检测凋亡细胞数量;（2）透射电镜下观察神经元改变;（3）提取m RNA进行q PCR检测;（4）提取总蛋白,通过Western blot检测蛋白水平变化;（5）利用斑点杂交方法,检测基因组DNA总体甲基化改变;（6）对基因组DNA进行亚硫酸盐转化,MSP检测核纤层蛋白（Lmna）启动子区甲基化水平。第二部分:缺氧诱导因子1A（HIF1A）对DNA甲基化转移酶3L（DNMT3L）的调控机制研究构建大鼠缺氧诱导因子1A（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,Hif1a）过表达质粒,以及含DNA甲基化转移酶3l（DNA methyltransferase 3 like,Dnmt3l）和甲基化转移酶3a（DNA methyltransferase 3 alpha,Dnmt3a）启动子荧光素酶质粒,进行双荧光素酶实验;利用定点突变实验方法和染色质免疫共沉淀,确定HIF1A与Dnmt3l启动子结合位点;在PC12细胞中过表达Hif1a,q PCR和Western blot验证HIF1A对DNMT3L和DNMT3A的调控作用。第三部分:HIF1A-DNMT3L-LMNA轴对细胞凋亡的机制研究包装大鼠Dnmt3l过表达病毒,感染大鼠原代神经元,提取m RNA检测Lmna变化。在PC12细胞中:（1）过表达Hif1a和Dnmt3l后,q PCR及Western blot检测下游Lmna核酸及蛋白水平的变化;（2）过表达Dnmt3l后或敲低Lmna后,用流式细胞仪检测细胞凋亡;（3）过表达Dnmt3l和Dnmt3a后,通过双荧光酶素实验检测Lmna启动子的荧光素酶活性;以及过表达Dnmt3a后,用不同浓度的地西他滨处理细胞后,q PCR检测Lmna表达情况;（4）过表达Hif1a后,同时敲低Dnmt3l,Western blot检测LMNA的变化。在Dnmt3l敲入小鼠中,Western blot和q PCR检测胚胎20.5天（Embryo 20.5 days,E20.5 d）胎鼠前额叶LMNA蛋白及Lmna m RNA改变;透射电镜下观察前额叶神经元的细胞核膜改变;对前额叶蛋白进行免疫共沉淀,验证DNMT3L和LMNA存在蛋白质互作关系。体外GST pulldown实验验证DNMT3L和LMNA存在直接作用关系,并确定结合区域。实验结果:第一部分:子痫前期状态对大鼠胚胎神经元影响的研究1.成功构建PE动物模型,妊娠20.5天,PE组孕鼠蛋白尿、动脉血压升高,肾脏出现高血压肾病表现。2.PE组胎鼠体重、脑组织重量减小。3.胎鼠前额叶:（1）冰冻切片TUNEL染色,PE组凋亡细胞数增多;（2）电镜下观察到PE组神经元细胞核异形,核膜及细胞膜不完整,同时观察到线粒体出现破坏结构;（3）通过q PCR法、Western blot方法发现在PE组前额叶中,HIF1A、DNMT3A和DNMT3L表达水平升高,凋亡相关蛋白水平升高,而且与细胞核膜相关的蛋白LMNA降低;（4）PE组总体甲基化水平升高;（5）利用MSP检测甲基化位点,Lmna启动子甲基化水平在PE模型中有升高。第二部分:缺氧诱导因子1A（HIF1A）对DNA甲基化转移酶3L（DNMT3L）的调控机制研究4.HIF1A对Dnmt3l和Dnmt3a的启动子有转录激活作用,且通过定点突变试验证了HIF1A与Dnmt3l启动子转录激活位点。5.染色质免疫共沉淀实验验证了HIF1A对Dnmt3l启动子的调控位点。6.在PC12细胞中,验证了过表达Hif1a后,Dnmt3l和Dnmt3a m RNA及蛋白表达水平升高。第三部分:HIF1A-DNMT3L-LMNA轴对细胞凋亡的机制研究7.用过表达Dnmt3l的慢病毒感染大鼠元代神经元,Lmna m RNA表达降低。8.在PC12细胞中,过表达Hif1a和Dnmt3l后,q PCR及Western blot检测下游Lmna核酸及蛋白水平表达降低;DNMT3L对Lmna的启动子存在转录抑制作用,且该作用是独立于DNMT3A通过非甲基化途径对Lmna进行调控。9.过表达Dnmt3l后或敲低Lmna后,PC12细胞凋亡数量增加;过表达Hif1a,同时敲低Dnmt3l,LMNA降低水平有所恢复。10.在Dnmt3l敲入小鼠中,Western blot和q PCR检测E20.5 d胎鼠前额叶LMNA蛋白及Lmna m RNA表达降低;透射电镜下观察前额叶神经元的细胞核核膜不完整;通过免疫共沉淀,验证DNMT3L和LMNA存在蛋白质互作关系。11.体外GST pulldown实验验证DNMT3L和LMNA存在直接作用关系,且DNMT3L在可以结合到LMNA的核定位序列（nuclear localization sequence,NLS）区域。结论:1.在大鼠子痫前期模型中胎鼠（E20.5 d）前额叶中,HIF1A、DNMT3A和DNMT3L表达增多,总体甲基化水平升高;前额皮层神经元核膜不完整,LMNA表达降低,同时凋亡相关蛋白增多,导致了前额叶神经元发生凋亡。2.HIF1A可以作为Dnmt3l转录因子,对其发挥转录激活作用,也可能是HIE发展过程中对神经发育影响的重要机制之一。3.Dnmt3l表达升高或Lmna表达降低,会导致细胞凋亡。DNMT3L对Lmna启动子的转录抑制作用是独立于DNMT3A通过非甲基化途径对LMNA进行调控。HIF1A可以通过DNMT3L对LMNA进行调控,从而导致了细胞凋亡。