内容：心脑血管疾病包括心脏血管和脑血管疾病，是循环系统功能紊乱疾病的统称，其具有较高的发病率、致残率、复发率和较高的死亡率等特点，是全球范围内的首要死亡原因，严重威胁人类的生命健康。在中国，每年死于心脑血管疾病约有300万人，占死亡人口总数的51％左右。因此，心脑血管疾病的预防和治疗是药物研发领域的重要任务。　　心脑血管病的致病因素较多且颇为复杂，而血栓形成在其疾病的发生发展中起关键性作用，因此有效的预防和治疗血栓的形成对心脑血管疾病具有十分重大的意义。迄今为止，临床上用于预防和治疗血栓的抗凝药物主要有两类：肝素类（普通肝素、低分子肝素）和维生素K拮抗剂类（华法林），然而这些药物存在诸多不足，比如给药不方便、治疗窗窄、起效慢、诱发血小板减少症、易与食物药物相互作用等。因此，研发一种安全有效、高选择性的抗凝药物成为防治血栓性疾病的热点。　　中药归经理论历史渊源，它的理论可以追溯到《黄帝内经》，它体现了药物对机体某些脏腑或某些组织器官的选择性作用，即药物对机体作用的归属部位，是药物发挥作用的定位概念。适配子与靶物质的特异性结合作用类似于中药的归经作用，可以认为是对中药归经理论的新认识，有助于推动中药的现代化。　　核酸适配子是一种新型的医学分子工具，它是利用指数级富集的配体进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术从体外人工合成的随机寡聚核苷酸文库中筛选而来，能与靶分子高特异性和高亲和力的结合，可以用于血栓靶向载药与治疗，应用前景可观。从活血化瘀中药水蛭中提取的水蛭素是新一代高效特异的凝血酶抑制剂，本研究旨在通过筛选得到水蛭素载体——血栓靶向性的纤维蛋白特异性结合的核酸适配子，为心脑血管疾病的防治提供新策略。　　目的：　　由血栓形成导致心脑血管疾病的病发率逐年上升，抑制血栓的形成已成为国内外预防心脑血管疾病的热点和方向。本研究以凝血途径为着手点，以纤维蛋白作为靶物质，利用指数级富集的配体系统进化技术，从体外人工合成的99个核苷酸的随机寡核酸文库中筛选出与纤维蛋白高亲和力、高特异性结合的适配子——水蛭素载体，为靶向于血栓的新型水蛭素抗凝药物研发奠定基础。　　方法：　　1.设计并合成引物与核酸文库，在体外构建全长为99 nt的单链寡核苷酸随机文库，文库两端为18 nt的固定引物序列，中间为63 nt的随机序列。　　2.以羧基磁珠Dynabeads M-270 Epoxy为介质，包被纤维蛋白，并用BCA法测定纤维蛋白包被效率。　　3.利用 SELEX技术，通过磁力架分离结合与未结合的核酸分子，通过不断增加筛选压力（增加 tRN A量、增加洗涤次数、增加摇床频率、缩短结合反应时间），对核酸文库进行重复筛选，并在第6、9、12轮进行反筛——以空白磁珠与核酸文库结合，除去与纤维蛋白非特异结合的核酸分子，最终筛选出了纤维蛋白适配子；在筛选的偶数轮用荧光标记引物扩增文库，采用荧光定量间接法计算纤维蛋白与核酸文库的结合率，待结合率不再提高时停止筛选。　　4.把最后一轮筛选的适配子进行PCR扩增，纯化后连接T载体，进行T/A克隆，并转化大肠杆菌感受态菌，挑取单克隆菌落接种于氨苄青霉素（ampicillin，Amp）抗性的液体培养基中，于恒温摇床中震荡培养12-16小时，送公司测序，得到适配子的序列。　　5.用 BioEd it软件对所测适配子序列进行比对，分析适配子一级结构的特点。用DNAMAN8.0软件对适配子序列的二级结构进行模拟，分析适配子二级结构的结构特点。　　6.对所得适配子进行亲和力和特异性分析。用胶体金标记适配子，采用斑点渗滤法鉴定筛选出的纤维蛋白适配子的特异性。人工合成生物素标记的适配子，以碱性磷酸酶标记的亲和素系统连接酶与核酸适配子，通过酶促底物显色反应测定在450nm处的吸光值。利用软件GraphPad Prism5.0，绘制适配子结合曲线图，并用非线性回归分析其解离常数Kd值。　　结果：　　1.获得了全长为99 nt的单链寡核苷酸随机文库，库容量大约为1017~18。　　2.羧基磁珠成功的包被纤维蛋白，包被效率为87.65%。　　3.经过筛选压力递增的15个循环，获得了具有较高亲和力和较高特异性的纤维蛋白适配子群。　　4.第15轮所得适配子群经克隆、转化，挑取90个阳性克隆，恒温摇床孵育12~16小时后，送Invitrogen公司测序得57条适配子序列。　　5.利用 Bio Ed it软件对适配子序列一级结构比对，发现适配子序列之间存在相似片段，此为适配子保守序列，推测其为与纤维蛋白结合的结构基础。　　6.利用DNAMAN8.0软件对适配子二级结构进行模拟，发现适配子序列的二级结构有茎环、发夹、G-四聚体等，但多以茎环结构为主，且各适配子所形成的茎环数目、大小及位置不一，自由能也不同。　　7.用胶体金标记适配子斑点渗滤法检测所获得适配子的特异性，结果显示筛选出的纤维蛋白适配子具有较好的特异性。以生物素-亲和素-碱性磷酸酶系统测定不同浓度适配子与靶蛋白的结合力，绘制结合曲线，结果显示适配子与纤维蛋白具有较高的亲和力，解离常数Kd值达43.12 nmol/L。　　结论：　　本研究设计并构建了总长度为99nt的单链寡核苷酸随机文库，利用指数级富集配体的系统进化技术（SELEX），以磁珠为介质，经过筛选压力递增的15个循环，成功地获得了纤维蛋白适配子群。经过对适配子群克隆、测序，获得适配子的序列结构。胶体金标记适配子斑点渗滤法测定适配子的特异性，结果显示筛选到的适配子对纤维蛋白具有较高特异性。用生物素-亲和素-碱性磷酸酶系统测定不同浓度适配子与靶蛋白的结合力，结果显示筛选到的适配子对纤维蛋白具有较高的亲和力。高特异性、高亲和力纤维蛋白适配子的成功筛选，为今后靶向于血栓的药物研发奠定了良好基础。