前言经皮腔内冠状动脉介入术（percutaneous coronary intervention,PCI）是目前广泛应用的治疗冠心病手段之一,但PCI术后半年内血管重建部位再狭窄（restenosis,RS）影响了它的远期疗效。RS的机制很复杂,包括早期的血管弹性回缩和后期的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）增生、迁移、细胞外基质的产生以及血管重塑等。寻找抑制PCI术后RS的方法仍是当前研究的热点。脱氧核酶（deoxyribozyme,DRz）是一种具有酶催化活性的DNA分子,作为一种基因抑制剂有着实际的治疗作用。早期生长反应因子-1（early growth responsefactor-1,Egr-1）是一种锌指结构转录因子,在动脉损伤等外界刺激下被激活,诱导VSMC的分裂、增殖和内膜增生。本研究应用合成的Egr-1特异脱氧核酶（DNAenzyme/10-23DRz,ED5）及杂码ED5（scrambled ED5,ED5SCR）,转染至体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞中,观察其对大鼠VSMC增殖、凋亡和迁移的影响,探讨其抑制VSMC增殖和迁移的作用机制。实验方法1、寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide,ODN）ED5、ED5SCR的合成ED5、ED5SCR由大连宝生物工程有限公司合成。ED5碱基序列为:5′-CCGCTGCCAGGCTAGCTACAACGACCCGGACGT-3′,ED5SCR碱基序列为:5′-GCCAGCCGCGGCTAGCTACAACGATGGCTCCAC-3′,两侧下划线所示部分为寡核苷酸识别序列,中间为保守的催化活性区,在3′和5′端各有两个磷酸二酯键进行硫代磷酸修饰,以增加其稳定性。部分5′端用FITC标记,以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布。2、大鼠VSMC培养及实验分组采用组织块贴壁法原代培养:体重120～150g Wistar大鼠（中国医科大学实验动物中心提供）,无菌条件下取出胸主动脉,中膜切块贴壁,滴加含20%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素pH7.4的Dulbecco’smodified Eagle medium（DMEM）,置于37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱内培养。0.25%胰酶消化传代,传代以后使用含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素pH7.4的DMEM维持细胞生长。经形态学观察和采用α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）免疫细胞化学染色鉴定为VSMC。选取3～8代细胞进行实验。实验分组为:对照组、ED5组、ED5SCR组。实验时各组细胞均使用含10%FBS的不含抗生素DMEM培养;ED5组转染0.1μmol/L ED5;ED5SCR组转染0.1μmol/LED5SCR。3、VSMC ODN的转染VSMC使用含10%FBS不含抗生素的DMEM培养,生长至70%后更换无血清无抗生素DMEM培养30h,进行第一次基因转染,18h后更换含10%FBS无抗生素的DMEM进行二次转染。FuGENE6/ODN转染复合物制备:在1.5ml无菌Eppendorf管中加入无血清无抗生素DMEM,再取适量的FuGENE6加入Eppendorf管中混匀并孵育5min,按FuGENE6与ODN 3:1（体积与质量之比）的比例分别加入ED5、ED5SCR并混匀,室温孵育15min。以0.1μmol/L浓度将转染复合物逐滴加入相应分组细胞中,转染结果用荧光显微镜和流式细胞仪（flowcytometry,FCM）检测。4、实验检测方法噻唑蓝[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法和5-溴脱氧尿嘧啶（5-bromodeoyuridine,BrdU）掺入法测定ODN转染对VSMC增殖的影响;FCM分析ODN转染对VSMC细胞周期分布的影响;用FCM和荧光显微镜检测ODN转染对VSMC凋亡的影响;用改良的Boyden小室法（Transwell）、划痕损伤模型测定ODN转染对VSMC迁移的影响;用RT-PCR检测Egr-1、PCNA、TGF-β1、p53、p21、Bax、MMP-14、MMP-2、TIMP-2mRNA表达的变化,用Westernblot检测细胞Egr-1、PCNA、TGF-β1、p53、p21、MMP-14、MMP-2、TIMP-2蛋白表达水平,免疫细胞化学法检测Egr-1、cyclin D1蛋白表达。实验结果1、组织块贴壁法培养5～6天后可见细胞从组织块边缘处长出,3周后长成单层,呈典型“峰-谷”样生长。VSMC特异性标志蛋白α-SM-actin免疫细胞化学染色阳性。贴壁法培养可获得高纯度的VSMC,可传代培养至24代,10代以后细胞的增殖能力逐渐降低。2、倒置荧光显微镜检测ED5、ED5SCR转染VSMC阳性率分别为70.6±1.52%、72±2.73%,可以看到大多数为细胞浆染色,少数为细胞核染色,其机理为细胞内吞作用。流式细胞仪检测ED5、ED5SCR转染VSMC的摄取率分别为13.5%、15.2%。3、ED5组VSMC的MTT吸光度值较ED5SCR、对照组显著降低,转染后24、48、72h,ED5对VSMC增殖抑制率分别为25%、20%、18%,ED5SCR组与对照组比较无差别。ED5可明显抑制10%FBS诱导的体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖。4、BrdU掺入实验显示:对照组、ED5组与ED5SCR组BrdU标记率分别为30.46±4.38%、15.37±2.32%、29.17±4.15%。与其它两组相比,ED5组BrdU标记率明显减少,差异具有显著性（P＜0.01）;ED5SCR与对照组比较无差别。说明ED5转染显著抑制S期DNA的合成,抑制VSMC增殖。5、细胞周期分析显示,ED5组G₀/G₁期细胞百分比高于对照组、ED5SCR组,而S期比例低于对照组、ED5SCR组,细胞增殖指数降低,表明ED5可阻止细胞周期由G₀/G₁期向S期推进,使细胞停留在G₀/G₁期,从而抑制VSMC增殖。6、FCM AnnexinⅤ/FITC、PI双染及Hoechst33342/PI荧光双染测定ED5、ED5SCR对VSMC凋亡无影响。7、划痕损伤模型测定转染72h后,对照组、ED5组与ED5SCR组VSMC迁移距离分别为159.62±9.57、65.35±5.04、162.84±8.43μm,结果发现同其它两组相比,ED5明显抑制VSMC迁移（P＜0.01）,而ED5SCR对VSMC迁移无影响。8、改良的Boyden小室法测定ED5转染后6h,VSMC迁移抑制率为32.18%（P＜0.01）。ED5SCR对VSMC迁移无影响。9、RT-PCR检测到:与ED5SCR、对照组相比,ED5转染抑制VSMC Egr-1、PCNA、TGF-β1、MMP-14、MMP-2mRNA表达,对p53、p21、Bax、TIMP-2mRNA表达无影响。10、Western blot检测到:与ED5SCR、对照组相比,ED5转染抑制VSMC Egr-1、PCNA、TGF-β1、MMP-14、MMP-2蛋白表达,对p53、p21、TIMP-2蛋白表达无影响。未检测到Bax蛋白表达。11、免疫细胞化学检测到ED5转染抑制VSMC Egr-1、cyclin D1蛋白表达,ED5SCR对VSMC Egr-1、cyclin D1蛋白表达无影响。结论1、ED5可特异地抑制Egr-1及其相关基因的表达,抑制10%FBS诱导的体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖,此作用与其阻止细胞周期由G₀/G₁期向S期推进,抑制S期细胞合成,抑制cyclin D1、TGF-β1表达有关。ED5SCR无上述作用。2、ED5可特异地抑制Egr-1,抑制MMP-14表达,减少MMP-2的激活,抑制VSMC的迁移。ED5SCR无上述作用。3、ED5、ED5SCR对VSMC凋亡无影响。