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植物寄生线虫在自然界中分布广泛,且宿主范围广、存活时间长,是植物中最常见的病原之一,也给农林业造成了巨大的经济损失。尽管目前化学农药仍然是控制线虫病害的主要手段,但是由其带来的环境污染问题和人类生活水平的提高,以绿色安全的生物防治取代传统的农药已迫在眉睫。而食线虫微生物具有的低毒性、低残留以及无抗药性等特点已经成为生物防治线虫新的突破口。但食线虫细菌侵染线虫的相关毒力因子及其作用分子机制研究仍然十分缺乏,主要仍集中在伴孢晶体和毒性胞外蛋白酶的研究上。因此,本研究以定植于植物根部、可产生丰富次生代谢产物并具有显著促植物生长的解淀粉芽孢杆菌FZB42(BacillusamyloliquefaciensFZB42)为研究对象,在该菌株全基因组测序完成的有利背景下,通过已构建的全基因组的随机突变文库,对该细菌参与线虫侵染相关的新致病基因进行了筛选和鉴定,并对筛选到的新基因参与的代谢途径以及产物进行探讨,从而进一步丰富了食线虫细菌侵染线虫的分子机制。
通过杀线虫生测对突变株进行初筛和复筛,从随机突变文库中的300多个突变子中得到2个相对于野生株杀线虫活性减弱的突变子:F5和B54。然后通过反向PCR技术对这两株突变子进行突变基因的定位和克隆,确定了F5和B54突变子中突变基因的位置都在hypotheticalprotein(RBAM_00747)中简称为hp基因。为了验证该基因的功能,利用野生型FZB42构建了hp的定点突变株HP9,并对B54、HP9和FZB42进行生测实验,发现相对于野生FZB42,B54和HP9在的杀线虫能力都有较显著的降低。此外,有文献报道hp在解淀粉芽孢杆菌FZB42中参与噻唑、恶唑杂环化合物的合成,于是我们根据文献的报道提取了野生株FZB42和突变株HP9中这种化合物,进行了杀线虫生测实验,结果得出hp和该基因所参与编码的噻唑/恶唑杂环化合物在解淀粉芽孢杆菌FZB42侵染线虫中起重要的作用。
本文主要结果为:
1.B.amyloliquefaciensFZB42中与侵染线虫相关新的功能基因的鉴定。通过线虫生测实验,从解淀粉芽孢杆菌FZB42随机突变文库的300多个突变子中筛选出2个侵染线虫活性相对于野生FZB42显著下降的突变子:F5和B54。经过反向PCR鉴定得到转座子的插入位点都在RBAM_007470(hp),为侵染线虫相关的的新功能基因提供物质基础。
2.hp基因在侵染线虫过程中的功能及其验证。在野生FZB42中构建了hp基因的敲除菌株HP9,并对B54、HP9和FZB42进行了杀线虫生测验证,结果显示:hp基因敲除后FZB42的杀线虫活性分别在固体和液体生测中分别有10%和30%左右的降低,从而证实hp基因在FZB42杀线虫过程中起重要的作用。
3.hp基因参与合成的噻唑/恶唑类杂环化合物与线虫侵染相关。通过对HP9和野生株FZB42胞外物质的萃取,浓缩和透析,发现与野生株FZB42相比,HP9的胞外提取物经LC-TOF-MS检测后发现缺失噻唑/恶唑杂环化合物,确定hp基因参与该类化合物的合成。在此基础上,通过对野生菌株FZB42胞外物质的初步制备,得到含有该化合物的粗品,并对该物质进行了杀线虫的生测,发现hp基因参与合成的噻唑/恶唑杂环化合物可以促进线虫的死亡,为研究细菌侵染线虫的机制提供了新的思路。
本论文的创新主要体现为:
1.迄今为止国内外还没有任何解淀粉芽孢杆菌FZB42杀线虫相关基因的报道。因此,本研究首次揭示了解淀粉芽孢杆菌FZB42中与杀线虫相关的基因hp(RBAM_007470)在侵染线虫中的作用。
2.首次研究并发现hp基因参与合成的噻唑/恶唑类化合物在线虫侵染中起重要的作用。