本研究采用RNA干扰技术,对大麦条纹病菌(Pyrenophora graminea)中的基因Pgmiox进行功能研究。从野生株QWC中克隆该基因,构建其RNA干扰载体,经过PEG介导遗传转化,以潮霉素抗性筛选获得54株转化子,随机选择6个突变菌株进行功能分析,明确Pgmiox基因在大麦条纹病菌中致病性的功能机制,为该病原菌的基因调控机理和致病机制奠定基础。主要结论如下所示:1.本试验克隆到大麦条纹病菌基因Pgmiox,并对其进行生物信息学分析。结果得出:该基因没有内含子,基因全长981bp,Pgmiox基因编码326个氨基酸,将基因提交注册到GenBank,序列号为MK302448;软件分析该基因编码蛋白的等电点约为4.93,得出该蛋白为酸性蛋白;预测其二级结构,以α-螺旋(Alpha helix,Hh)为主占到46.93%;蛋白结构域分析得出该基因有一个Pfam域miox结构域;构建的系统进化树得出,大麦条纹病菌(P.graminea)和小麦褐斑长蠕孢霉菌(Pyrenophora tritici-repentis)的肌醇加氧酶基因蛋白序列聚合在一起。2.运用干扰片段Pgmiox1、片段Pgmiox2和载体pSilent-1成功构建Pgmiox基因的RNA干扰载体pSilent-1Pgmiox,制备出野生株QWC的原生质体,经过PEG4000介导遗传转化,通过潮霉素抗性筛选获得54株转化子,随机选择6个干扰突变菌株△Pgmiox32、△Pgmiox33、△Pgmiox35、△Pgmiox43、△Pgmiox44和△Pgmiox54,用实时荧光定量PCR测定干扰率,分别为90.36%、89.87%、88.47%、90.56%、90.75%和88.03%。3.功能验证分析得出:Pgmiox基因的干扰突变显著影响了大麦条纹病菌的营养生长;Pgmiox与大麦条纹病菌响应不同环境胁迫相关;该基因参与调控大麦条纹病菌菌丝的细胞壁完整性;4种抑真菌剂耐性试验中,Pgmiox基因加强了病菌对异菌脲和咪鲜胺的敏感性,戊唑醇和苯并咪唑胁迫时,干扰株速率显著升高,生长速度快于对照QWC菌株,Pgmiox基因干扰菌株对这两种药剂耐受性增加,该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点。毒素试验中,6个干扰菌株诱导出的粗毒素与野生株QWC颜色明显不同,野生株粗毒素液体呈现深褐色,干扰株液体普遍呈淡黄色。将毒素液体注射到盆栽大麦同一部位叶片中,注射QWC菌株毒素的叶片完全发病,叶片萎缩,呈深褐色,注射干扰株毒素的叶片明显发病减弱,叶片整体呈绿色,仅注射部位呈褐色,Pgmiox基因参与调控大麦条纹病菌毒素致病性。致病性盆栽试验中,6个干扰菌株的发病率较对照QWC菌株显著降低,经QWC菌株“三明治法”侵染的大麦长势较弱,发病较为严重,叶片萎缩干瘪呈黄褐色,干扰株侵染的大麦,长势较壮,发病明显较弱,叶片呈黄绿色,出现较少病斑。致病性离体试验中,野生株QWC菌饼的侵染处,叶片明显发病,出现病变,呈黄褐色病斑,6个干扰株侵染的叶片,发病较轻,菌饼侵染处呈浅黄色,未形成病斑,Pgmiox基因参与调控大麦条纹病菌致病性。