研究背景放射性碘造影剂广泛应用于临床侵入性影像学检查。造影剂导致的急性肾损伤（contrast-induced acute kidney injury,CI-AKI）是临床诊断和介入手术中血管内注射造影剂（Contrastmedia,CM）后发生的重要并发症,是住院患者在医院内获得性急性肾衰竭的第三大常见原因,它使得患者住院时间延长并且影响远期预后,同时也使院内死亡率增加,社会医疗负担加重。尽管临床上广泛采用水化治疗等手段预防CI-AKI,但迄今CI-AKI的防治效果仍不尽如人意,特别对于老年患者、高血压、心力衰竭和肾功能不全的患者的使用却受到限制。此外,水化治疗联合药物干预可以使CI-AKI的发生率进一步降低,改善患者的远期预后。因此,药物研究逐渐成为CI-AKI当前的研究热点。CI-AKI通常是指使用造影剂后48-72h内发生的急性或亚急性肾损伤,即:血肌酐（Serum creatinine,SCr）升高水平大于基础值的25%或者大于44.2μmol/L,并排除其他疾病所致。既往研究证实,氧化应激、细胞凋亡和炎症等多种机制参与了 CI-AKI的发生发展,但目前尚未完全阐明。其中,含碘造影剂对肾小管上皮细胞和血管内皮细胞的直接细胞毒性作用导致细胞肿胀和空泡化,细胞发生凋亡,最终坏死,但确切的机制未明。碘造影剂导致的肾脏血流动力学改变以及细胞因子水平改变引起的肾髓质缺血缺氧也是肾损伤的重要机制之一。氧化应激处于这些机制中的核心地位,其产生的活性氧（Reactiveoxygen species,ROS）的作用越来越受到重视,过量的ROS可以直接损伤肾小管上皮细胞和邻近细胞。此外,ROS可以通过激活应激激酶和固有途径引起肾细胞凋亡,包括c-Jun N-末端激酶、p38 MAPK应激激酶和Caspase。这些信号转导在造影剂刺激时的反应主要在线粒体上,从而导致线粒体外膜通透性增加和细胞色素c以及其他促凋亡因子的释放。细胞色素c可以结合凋亡蛋白酶激活因子-1和促进其与Caspase9的结合以形成凋亡复合体,从而激活Caspases导致细胞凋亡。ROS和CM的渗透压力以及受损的肾小管上皮细胞释放的损伤相关分子可以激活NOD样受体家族核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（Nod-like receptor pyrin containing 3,NLRP3）,NLRP3募集Caspasel和促进炎性小体的形成。激活的Caspasel可以剪切pro-IL-1β为有活性的IL-1β,从而激活炎症瀑布反应。这些证据表明肾脏细胞凋亡和炎症反应可能在CI-AKI的发病机理中起重要作用。褪黑素（Melatonin,Mel）是一种由脑松果体分泌的具有调节昼夜节律的激素,在1958年由Lerner发现并从牛松果体中分离出来,它属于吲哚杂环类化合物,其化学名是N-乙酰基-5甲氧基色胺。褪黑素具有强大的清除自由基及抗氧化能力。此外,由于褪黑素具有高度亲脂的特性,它可以很容易的穿过细胞膜和生理性屏障（比如血脑屏障）从而影响各个脏器的生理功能。文献表明,褪黑素能够预防多种疾病,包括炎症性疾病、高血压、缺血/再灌注损伤,以及其他心血管疾病。而且最近的研究证实,褪黑素的心血管以及肾脏保护作用主要与其抗氧化、抗凋亡和抗炎作用相关。然而,褪黑素在CI-AKI中的作用和机制尚不明确。基于以上研究结果,本研究拟运用CI-AKI小鼠模型和肾小管上皮细胞损伤模型,阐明褪黑素在CI-AKI中的保护作用,初步探讨其作用的分子机制,从而为临床上预防造影剂导致的急性肾损伤寻找新的契机和药物治疗靶点提供理论依据。研究目的1.探讨褪黑素在CI-AKI小鼠模型中肾脏损伤的作用;2.明确褪黑素对CI-AKI小鼠肾脏保护的作用机制;3.探讨褪黑素对CI-AKI小鼠发挥保护作用的可能分子机制。研究方法1.动物模型的建立和分组8周龄129野生型小鼠（Wild type,WT,129S1/SvImJ）购买于北京维通利华实验动物技术有限公司,60只雄性小鼠适应性喂养一周后随机分为以下4组:①对照组（Control组）;②褪黑素组（Mel组）;③急性肾损伤模型组（CM组）;④急性肾损伤模型+褪黑素组（CM+Mel组）。其中急性肾损伤模型小鼠提前禁水16小时后腹腔注射吲哚美辛（1Omg/kg）和N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME,10mg/kg）,15分钟后以3.0g Iodine/kg剂量尾静脉注射碘海醇（Iohexol,350mg Iodine/ml）,对照组小鼠在每个相同时间点给予等体积的生理盐水。褪黑素组小鼠在尾静脉注射碘海醇前30分钟腹腔注射褪黑素（20mg/kg）。24小时后以安乐死处死小鼠,小鼠心脏取血用于检测肾功能,留取双肾标本进行组织学和分子学研究。2.血清学指标检测将留取的血液标本分离血清,行血清学指标检测。检测血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平用以评价肾功能。3.组织病理学检测实验末,称取小鼠体重和肾脏重量。将各组小鼠肾脏行4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋制备切片。H＆E染色观察肾脏组织大体形态并进行肾脏损伤程度评分,免疫组织化学染色观察肾脏组织内中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（Neutrophil gelatase-associated lipid carrier proteins,NGAL）、Bax、Bcl2、cleaved Caspase3和Nox4的分布及表达情况。4.肾脏组织中MDA、SOD和GSH-Px检测按照相应试剂盒操作说明检测肾脏皮质组织中丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。5.细胞培养和处理将大鼠NRK-52E肾小管上皮细胞系使用1640培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素进行培养。待细胞长到密度约80%时按照不同组别给予褪黑素（100μmol/L）预处理和碘海醇（100 mgI/mL4h）刺激细胞。6.TUNEL 检测肾脏组织按照标准步骤制作冰冻切片和细胞爬片固定后,0.1%Triton X-100打孔,每个标本滴加30μl反应液,37℃避光孵育1小时,封片后荧光显微镜下观察小鼠肾脏组织中肾小管上皮细胞和NRK-52E细胞的细胞核DNA损伤程度。7.实时定量RT-PCR剪取肾脏皮质组织或者收集细胞后,提取RNA,经过逆转录、实时荧光PCR扩增等检测不同组间相关基因mRNA的表达差异。8.ROS检测用DCFH-DA法检测NRK-52E细胞内ROS水平,细胞用含/不含褪黑素的无血清培养基预处理1h,再继续用碘海醇刺激4h。去除细胞培养基,加入终浓度为10μmol/L的DAFH-DA无血清培养基1ml,细胞孵箱中避光培养40分钟。PBS洗涤细胞3遍后,用倒置荧光显微镜观察不同组间ROS的产生。9.蛋白免疫印迹（Western blot）剪取各组肾皮质组织或者收集细胞,提取蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度后进行SDS-PAGE。电泳结束后,将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭1h,然后分别用特异性一抗4℃摇床过夜孵育。次日用鼠或兔二抗室温孵育1.5h,利用AI680化学发光仪显影,并用Image J软件分析。10.统计学分析实验结果采用Graphpad Prism 8.0.1软件进行统计学分析,结果以均数±标准误（Mean±SEM）表示,独立样本t检验用来比较两组间差异。多组之间比较利用单因素方差分析（one-way ANOVA）,P＜0.05认为具有统计学差异。研究结果1.褪黑素预处理可改善造影剂导致的小鼠急性肾损伤肾功能检测结果显示,与对照组相比,CM组小鼠出现明显的肾功能损伤。免疫组织化学染色可见,CM组肾脏损伤标志物NGAL的表达较对照组也明显升高。进一步的H＆E染色结果表明,与对照组相比,CM组小鼠发生了明显的病理学损伤,包括肾间质弥漫性水肿、肾小管上皮细胞出现严重颗粒和空泡化、肾小管上皮细胞骨架结构被破坏和管型形成。上述结果均表明CM组小鼠发生了较严重的肾脏损伤。与CM组比较,当给予褪黑素预先处理后,上述肾脏损伤的情况均明显减轻。2.褪黑素预处理可减轻造影剂引起的肾脏氧化应激Western blot结果显示,与对照组比较,CM组小鼠Nox4水平明显增加,但褪黑素预处理后Nox4水平明显下降。同时,免疫组织化学染色显示,与对照组相比,CM组小鼠Nox4表达含量升高,当给予褪黑素预处理后肾脏组织中Nox4的表达显著降低。此外,氧化酶活性及RT-PCR结果显示,与对照组相比,CM组小鼠肾皮质组织中,MDA水平升高、SOD和GSH-Px酶活性降低以及过氧化氢酶（Catalase,CAT）的mRNA含量降低。与CM组相比,褪黑素预处理小鼠MDA水平降低、SOD和GSH-Px酶活性升高、CAT的mRNA水平增加。以上结果表明,褪黑素药物预处理可减轻造影剂导致的肾脏氧化应激。3.褪黑素预处理可降低造影剂引起的肾脏中肾小管上皮细胞凋亡小鼠肾皮质组织进行Western blot结果显示,与对照组相比,CM组小鼠肾脏组织中Bax、cleaved Caspase3蛋白表达水平明显升高,Bc12蛋白水平明显降低。与CM组相比,褪黑素预处理组小鼠肾脏组织Bax、cleaved Caspase3蛋白水平显著降低,Bc12蛋白水平显著升高。同时,免疫组织化学染色结果与Western blot结果一致。另外,我们对4组小鼠肾脏组织切片进行了 TUNEL染色。与对照组相比,CM组小鼠肾脏组织中TUNEL阳性细胞比例显著增加。与CM组相比,褪黑素预处理组小鼠肾脏组织中TUNEL 阳性细胞比例显著减少。以上研究结果表明,褪黑素可降低造影剂导致的肾脏组织中细胞凋亡。4.褪黑素预处理可减轻造影剂导致的肾脏炎症反应为了探讨褪黑素对造影剂导致的肾损伤的炎症反应情况的影响,我们检测了肾脏皮质组织中炎症因子的变化。与对照组相比,CM组小鼠肾脏组织中IL-1β、TNFα和TGFβ的mRNA水平显著升高。当CM组小鼠给予褪黑素预处理后,上述炎症因子的mRNA水平显著降低。这些结果说明,褪黑素药物预处理对造影剂引起的肾脏炎症反应具有抗炎作用。5.褪黑素预处理可降低碘海醇介导的NRK-52E细胞氧化应激Western blot结果显示,与对照组相比,碘海醇干预后细胞内Nox4蛋白水平明显升高。与碘海醇组相比,NRK-52E细胞给予褪黑素预处理后,Nox4水平明显下降。与对照组相比,NRK-52E细胞用碘海醇干预后ROS的产生明显增加。进一步使用褪黑素药物预处理,细胞内ROS的水平明显下降。6.褪黑素预处理可降低碘海酵诱导的NRK-52E细胞凋亡Western blot结果显示,与对照组相比,碘海醇刺激后Bax和cleaved Caspase3蛋白水平显著升高,Bcl2蛋白水平显著降低。与单纯碘海醇组相比,褪黑素预处理后Bax和cleaved Caspase3蛋白水平明显降低,Bcl2蛋白水平明显升高。同时,TUNEL染色表明,与对照组相比,碘海醇刺激后TUNEL阳性细胞比例明显升高。然而,当给予褪黑素药物预处理后TUNEL阳性细胞的比例明显降低。7.褪黑素预处理可减轻碘海醇导致的NRK-52E细胞炎症反应RT-PCR实验显示,与对照组相比,碘海醇刺激后,细胞的IL-1β、TNFα和TGFβ的mRNA水平显著升高。这表明了碘海醇干预后NRK-52E细胞发生了炎症反应,但给予褪黑素预处理后,上述炎症因子的mRNA水平明显下降。我们的结果证明了褪黑素发挥了抗炎作用从而减轻碘海醇导致的细胞炎症反应。8.Sirt3蛋白水平在CI-AKI模型中升高,褪黑素预处理可增加其表达和活性动物实验的蛋白免疫印迹表明,与对照组比较,CM组小鼠Sirt3的表达含量明显增加,这说明Sirt3在造影剂导致的小鼠急性肾损伤中发挥了重要的作用。此外,在给予褪黑素预处理后,与CM组相比,CM+Mel组Sirt3的表达水平进一步增加。而且,用以表示Sirt3活性的ac-SOD2 k68的表达水平明显下降,即Sirt3的活性增加。细胞实验得到了同样的结论。我们的结果均表明Sirt3在CI-AKI中发挥了重要作用,褪黑素可以增加其表达和活性。研究结论1.褪黑素在造影剂导致的小鼠急性肾损伤中具有保护作用;2.褪黑素通过抗氧化应激、抗凋亡和抗炎作用在保护造影剂诱导的小鼠急性肾损伤中发挥保护作用;3.褪黑素对造影剂导致的小鼠急性肾损伤的保护作用的分子生物学机制可能通过激活Sirt3来实现。研究背景随着社会经济和医疗条件的提高,心血管疾病发病率逐年上升。经皮冠状动脉内介入治疗（Percutaneous coronary intervention,PCI）是目前治疗冠状动脉粥样硬化心脏病最有效的方法之一,因此越来越多的患者选择PCI治疗。近年来,随着介入技术的迅速发展,造影剂导致的急性肾损伤（Contrast-induced acute kidney injury,CI-AKI）发病率也随之升高。有研究报道,CI-AKI发病率超过10%,老年患者多因自身肾功能衰退及合并糖尿病、高血压或其他基础疾病等,CI-AKI发病率较其他人群更高,严重者可引起急性肾功能衰竭,病死率高,预后差。目前临床上尚缺乏有效的治疗手段,因此降低CI-AKI的发生率逐渐引起临床医生的重视。CI-AKI是应用含碘造影剂最常见的并发症,其发生机制非常复杂,目前尚未完全阐明。现有很多研究证实多种机制参与了 CI-AKI的发生发展,其中肾脏实质缺氧损伤（尤其是肾髓质）和造影剂（Contrastmedia,CM）对肾微血管和肾小管的毒性作用是最重要的两个因素。肾脏髓质缺血缺氧使肾内舒血管物质与缩血管物质之间的平衡打破,最终结果是缩血管物质增加,继而发生肾小管坏死,从而形成恶性循环。血流量减少激活活性氧（Reactive oxygen,ROS）的释放,导致脂质过氧化以及细胞毒性损伤增加,此外,在CM的作用下肾小管细胞发生氧化应激和渗透性坏死,或空泡样变,最终导致细胞凋亡。不仅如此,CM可激活内源性或者线粒体途径介导细胞凋亡。Bax是Bcl2蛋白家族中促凋亡的重要成员,可导致细胞色素c的释放,从而激活Caspase3通路促进凋亡的发生。所以,抑制氧化应激和凋亡可以保护造影剂急性肾损伤。褪黑素（Melatonin,Mel）最初是作为一种具有调节昼夜节律的激素而被大众所熟知,人体多个器官均能产生,但其主要是由松果体合成和分泌的。已证实,褪黑素在肾脏疾病中发挥重要的保护作用。有研究报道,松果体切除后顺铂可诱发严重的急性肾损伤,褪黑素补充治疗可降低肾损伤,其机制可能与褪黑素具有强大的抗氧化应激、抗凋亡和抗炎的生理特性有关。最近研究发现褪黑素不仅减少ROS、清除氧自由基,而且可以上调抗氧化应激酶水平和下调促氧化酶水平。我们的前期实验也证明褪黑素对造影剂诱导的小鼠急性肾损伤具有保护作用,但是具体机制目前尚未完全阐明。沉默信息调节因子 3 蛋白（Silent Information Regulator 2 Associated Protein 3,Sirt3）是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的组蛋白去乙酰化酶,主要存在于线粒体基质与细胞核中,调节衰老、癌症、糖代谢和能量稳态。有研究表明Sirt3可以稳定线粒体,减少细胞内ROS的产生以及降低氧化应激、炎症、凋亡。最近文献报道Sirt3可以通过增强线粒体融合保护心脏和肾脏缺血再灌注损伤。这些提示Sirt3可能在CI-AKI中发挥重要作用。综上,褪黑素是否通过激活Sirt3的表达和活性发挥对小鼠造影剂急性肾损伤的保护作用目前尚不清楚。我们拟用Sirt3基因敲除小鼠（Sirt3-/-）和同品系野生型小鼠构建CI-AKI模型,阐明褪黑素发挥肾脏保护作用的具体机制。研究目的1.明确Sirt3-/-小鼠在造影剂作用下较野生型小鼠是否发生更严重的急性肾损伤;2.探讨Sirt3在褪黑素对CI-AKI发挥保护作用的机制;3.阐明褪黑素通过调节Sirt3信号通路减轻造影剂急性肾损伤。研究方法1.动物模型的构建与分组8周龄129野生型小鼠（Wild type,WT）和Sirt3-/-小鼠各30只,适应性喂养一周后,随机分为以下4组:①WT+CM组;②Sirt3-/-+CM组;③WT+CM+Mel组;④Sirt3-/-+CM+Mel组。其中急性肾损伤小鼠模型通过尾静脉注射造影剂（碘海醇）实现,具体方法同论文第一部分。药物干预组在注射造影剂前30分钟腹腔注射褪黑素（20mg/kg）。24小时后安乐死小鼠。2.血清学检测将留取的血液标本分离血清,行血清学指标检测。检测血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平用以评价肾功能。3.组织病理学检测实验末,称取小鼠体重和肾脏重量。将各组小鼠肾脏行4%多聚甲醛固定,石蜡包埋制备切片。H＆E染色观察肾脏组织大体形态并进行肾脏损伤程度评分,免疫组织化学染色观察肾脏组织内中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）、Bax、Bcl2、cleaved Caspase3 和 Nox4 的分布及表达情况。4.肾脏组织中MDA、SOD和GSH-Px检测按照相应试剂盒操作说明检测肾皮质组织中丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。5.细胞培养将大鼠NRK-52E肾小管上皮细胞系使用RPMI-1640完全培养基培养。用小干扰RNA沉默Sirt3表达,常规方法换液和传代。6.TUNEL 检测肾脏组织制作冰冻切片和细胞爬片固定后,0.1%Triton X-100打孔,每个标本滴加30ul反应液,37℃避光孵育1小时,封片后荧光显微镜下观察小鼠肾皮质组织和NRK-52E细胞的细胞核DNA损伤程度。7.实时定量RT-PCR剪取肾脏组织或者收集细胞后,提取RNA,经过逆转录、实时荧光PCR扩增等检测不同组间相关基因mRNA的表达差异。8.ROS检测用DCFH-DA法检测NRK-52E细胞内ROS水平。细胞实验结束后,去除原细胞培养基,加入终浓度为10μmol/L的DAFH-DA无血清培养基lml,细胞孵箱中避光培养40分钟。用倒置荧光显微镜观察不同组间ROS的产生情况。9.蛋白免疫印迹剪取各组肾皮质组织或者收集细胞,提取蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度后进行SDS-PAGE。电泳结束后,将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭1h,然后分别用特异性一抗4℃摇床过夜孵育。次日用鼠或兔二抗室温孵育1.5h,利用AI680化学发光仪显影,并用ImageJ软件分析。10.统计学分析实验结果采用Graphpad Prism 8.0.1软件进行统计学分析,结果以均数±标准误（Mean±SEM）表示,独立样本t检验用来比较两组间差异。多组之间比较利用单因素方差分析（one-way ANOVA）,P＜0.05认为具有统计学差异。研究结果1.Sirt3基因敲除可逆转褪黑素改善造影剂急性肾损伤的作用肾功能检测结果发现,与野生型小鼠相比,Sirt3-/-小鼠出现明显的肾功能损伤。免疫组织化学染色可见,肾脏早期损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（Neutrophil gelatase-associated lipid carrier proteins,NGAL）较野生型小鼠也明显升高。组织病理学H＆E染色进一步表明,与野生型小鼠相比,Sirt3-/-小鼠变现出更严重的损伤,包括肾小管上皮空泡样变、细胞严重颗粒化、肾间质弥漫性水肿、肾小管上皮细胞骨架结构破坏。这些结果提示Sirt3-/-小鼠发生了更严重的肾脏损伤。当给予褪黑素预处理时,与野生型小鼠比较,Sirt3-/-小鼠肾脏损伤的情况并不能改善。综上,我们的数据表明Sirt3-/-小鼠较野生型小鼠发生更严重的急性肾损伤且褪黑素的保护作用减弱。2.在CI-AKI模型中,褪黑素通过增加Sirt3的表达和活性发挥抗氧化应激作用Western blot检测发现,与野生型小鼠比较,Sirt3-/-小鼠Nox4水平明显增加,然而两组给予褪黑素处理后,Sirt3-/-小鼠Nox4水平并没有降低。此外,与野生型小鼠相比,Sirt3-/-小鼠ac-SOD2 K68表达水平显著升高,即Sirt3的活性是下降的。两组小鼠给予褪黑素处理后,ac-SOD2 K68表达水平降低情况在Sirt3-/-小鼠中没有出现。同时,免疫组化染色显示,Sirt3-/-小鼠皮质组织中Nox4含量较野生型小鼠中明显升高,但当两组给予褪黑素处理时,Sirt3-/-小鼠Nox4水平并没有降低。不仅如此,各组肾皮质组织中MDA含量、SOD和GSH-Px的活性以及过氧化氢酶（CAT）的mRNA水平得到了一致的结果。这些结果表明Sirt3敲除使褪黑素的抗氧化应激作用减弱。结合第一部分,我们得出褪黑素通过增加Sirt3的表达和活性发挥抗氧化应激作用。3.Sirt3基因敲除可逆转褪黑素对造影剂急性肾损伤小鼠的抗凋亡作用对各组小鼠肾皮质组织进行Western blot检测发现,与野生型小鼠相比,Sirt3-/-小鼠Bax、cleaved-Caspase3蛋白质水平明显升高,Bcl2蛋白水平明显降低。单纯褪黑素处理小鼠相比,Sirt3-/-小鼠Bax、cleaved-caspase3蛋白质水平显著升高,Bc12蛋白质水平显著降低。同时,凋亡相关蛋白免疫组化染色结果与Western blot结果一致。不仅如此,我们还进行了肾皮质组织冰冻切片染色。与野生型小鼠比较,Sirt3-/-小鼠TUNEL阳性细胞比例显著增加。两组给予褪黑素处理后,Sirt3-/-小鼠TUNEL阳性细胞比例并没有降低。综上,我们的数据表明,Sirt3基因敲除后小鼠发生严重的细胞凋亡且褪黑素的抗凋亡作用减弱。4.在CI-AKI模型中,Sirt3基因敲除可阻断褪黑素抗炎的保护作用我们还检测了 Sirt3基因敲除以及褪黑素处理后各组肾皮质组织中炎症因子的情况。与野生型小鼠相比,Sirt3-/-小鼠肾皮质组织中IL-1β、TNFα和TGFβ的mRNA水平显著升高。当两组给予褪黑素处理后,Sirt3-/-小鼠上述炎症因子水平并没有降低。这些结果说明,造影剂干预后Sirt3-/-小鼠炎症水平增加,Sirt3敲除使褪黑素抗炎的保护作用减弱。5.褪黑素通过增加Sirt3的表达和活性调控碘海酵诱导NRK-52E细胞氧化应激Western blot检测结果显示,与Iohexol组相比,NRK-52E细胞Sirt3基因沉默后Nox4蛋白水平明显升高。然而,当两组细胞给予褪黑素预处理后,Sirt3基因沉默组Nox4水平并没有降低。此外,与Iohexol组相比,Sirt3基因沉默组ac-SOD2 K68表达水平显著升高,Sirt3的活性下降。两组细胞给予褪黑素处理后,Sirt3基因沉默组ac-SOD2 K68表达水平没有出现降低。同时,ROS检测显示,Sirt3基因沉默组细胞内ROS水平较Iohexol组显著升高,但当两组细胞给予褪黑素处理时,ROS水平降低并没有出现在Sirt3基因沉默组。这说明Sirt3基因沉默使褪黑素的抗氧化应激作用减弱。结合第一部分细胞实验,我们得出褪黑素通过增加细胞内Sirt3的表达和活性发挥抗氧化应激作用。6.Sirt3介导褪黑素对碘海酵诱导的NRK-52E细胞抗凋亡的保护作用Western blot检测结果发现,与Iohexol组相比,Sirt3基因沉默组Bax和cleaved Caspase3蛋白水平显著升高,Bcl2蛋白水平显著降低。与单纯褪黑素处理相比,Sirt3基因沉默后Bax和cleaved Caspase3蛋白水平显著升高,Bcl2蛋白水平显著降低。此外,TUNEL染色显示,与Iohexol组相比,Sirt3基因沉默后TUNEL阳性细胞比例明显增加。给予褪黑素处理后这种趋势并没有得到改善。综上,我们得出在碘海醇诱发的NRK-52E细胞损伤中Sirt3基因沉默细胞凋亡增加且褪黑素的抗凋亡作用减弱。7.Sirt3参与褪黑素对碘海醇诱导的NRK-52E细胞抗炎的作用RT-PCR实验表明,与Iohexol组相比,Sirt3基因沉默组细胞中IL-1β、TNFα和TGFβ的mRNA水平显著升高。当两组细胞给予褪黑素处理后,Sirt3基因沉默组并没有使上述炎症因子水平降低。这些结果说明,Sirt3基因敲除后小鼠炎症水平增加且Sirt3参与褪黑素对细胞的抗凋亡作用。研究结论1.Sirt3敲除加重造影剂诱导的小鼠急性肾损伤;2.Sirt3介导褪黑素对造影剂急性肾损伤的抗氧化应激、抗凋亡和抗炎作用;3.褪黑素对造影剂急性肾损伤的保护作用分子机制部分是通过Sirt3依赖的信号通路实现的。