目的恶性肿瘤是一类严重危害人类身体健康的疾病,随着当代科学技术的不断发展,分子生物学和医学研究也随之进步,人们已经充分认识到肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂的生物学过程。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重影响了女性身心健康。近年来乳腺癌已成为发病率增长最快的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年升高趋势,且有年轻化倾向。乳腺癌的治疗以手术为主,术后辅助放化疗虽可改善患者的总生存和无病生存率,但易出现复发和转移。蒽环类/紫杉醇类化疗药物的先后问世,是乳腺癌内科治疗的一次重大突破,使乳腺癌的治愈率进一步得到了提高,但由于临床上一线和二线的广泛使用,大大增加了蒽环类及紫衫类药物的耐药性。尽管新的药物在不断涌现,但复发和转移性乳腺癌的治疗效果并不理想,曲妥珠单抗使HER2过表达乳腺癌患者能够获益,但治疗效果很有限。目前有关药物防治乳腺癌的效果尚不理想,或因毒副作用限制了其临床使用,中草药由于具有抑制肿瘤细胞增殖和凋亡作用,能增强患者生活质量和抗病能力,减少因手术、放化疗等损伤性治疗给患者带来的不良反应,而且其毒副反应小,价格低廉,因此从中草药中寻找具有抗乳腺癌的天然生理活性物质或先导化合物并了解其抗肿瘤作用的机制具有十分重要意义。槐耳是一种生长在古槐树上的药用真菌——槐栓菌,早在1500多年前就已经被作为药物用于治疗各种疾病,其功效主要有止血、止痢、抗癌、崩漏、痢疾、肝炎等。槐耳清膏为真菌槐耳菌质发酵后的热水提取产物,其主要抗癌活性成分为槐耳蛋白多糖(PS-T),含有多种有机成分和矿物质元素,具有扶正固本,活血化瘀作用。能诱导多种恶性肿瘤细胞的凋亡,增强机体免疫力,改善患者生活质量,同时对恶性肿瘤转移也具有一定的抑制效果,在乳腺癌的治疗中发挥着非常重要的作用。本课题以乳腺癌细胞系为研究对象,探讨槐耳清膏对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。从micro RNA水平研究槐耳清膏对乳腺癌细胞增殖和凋亡的分子机制,观察抑癌基因mi R-126的变化,进一步“寻本溯源”,探讨其对SOX2蛋白表达的影响。构建裸鼠异种乳腺癌移植瘤模型,研究槐耳清膏对MCF-7细胞致瘤性的影响,从而为临床槐耳清膏治疗乳腺癌提供理论依据。观察槐耳颗粒联合化疗与单纯化疗在治疗乳腺癌术后患者的生活质量和免疫功能的影响,为临床推广应用及进一步研究提供理论基础。方法1.将处于对数生长期的MCF-7及MDA-MB-231细胞各加入3mg/m L、6mg/m L、9mg/m L的槐耳清膏处理48小时,用MTT比色法测定OD值,计算其抑制率,同时观察细胞周期变化;流式细胞仪检测槐耳清膏对凋亡的影响;荧光显微镜下观察细胞形态结构的变化。2.槐耳清膏处理后的MCF-7细胞,运用实时定量PCR检测与乳腺癌相关的mi RNA表达普情况;PCR测定槐耳清膏作用于MCF-7细胞后,mi R-126的表达水平;MTT检测槐耳清膏对转染了mi R-126 inhibitor的MCF-7细胞的增殖情况;生物信息学预测结合文献查阅提示SOX2可能是mi R-126的靶基因,并采用PCR对靶基因m RNA表达进行测定,运用Western-Blot检测SOX2蛋白的表达水平。3.将裸鼠随机分为实验组和对照组,实验组给予槐耳清膏灌胃(浓度150mg/m L),每次灌胃0.2m L,每天两次,共30天。对照组:每只裸鼠每次灌胃0.9%生理盐水0.2m L,每天两次,共30天。观察裸鼠瘤体积及瘤体重的变化,显微镜观察移植瘤组织病理变化特点,并运用q RT-PCR检测两组裸鼠移植瘤组织中mi R-126表达的差异。4.经病理学检查确诊的乳腺癌术后患者90例,随机分为两组,治疗组:应用“FEC”方案化疗(环磷酰胺0.6/m2,静脉推注,d1,表阿霉素100mg/m2,静脉滴注,d1,5-氟尿嘧啶0.6/m2,静脉滴注,d1),同时口服槐耳颗粒,20克/次,3次/日,21天为一周期;对照组单纯行“FEC”方案化疗,化疗前后测定两组患者外周血NK细胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值,并观察生活质量的变化。结果1.MTT法检测不同浓度槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7细胞48h后的抑制率,与阴性对照组比较,各浓度组的OD值呈逐渐下降,在槐耳清膏浓度为3、6、9mg/m L时其细胞抑制率分别为(17.4±1.4)%、(58.6±3.7)%、(76.1±2.9)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。槐耳清膏作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后,与阴性对照组比较,各浓度组的OD值变化不大,在槐耳清膏浓度为3、6、9mg/m L时其细胞抑制率分别为(10.3±1.7)%、(15.1±2.6)%、(17.8±3.9)%,差异无统计学意义(P>0.05)。不同浓度槐耳清膏作用于MCF-7细胞48h后,早期凋亡比率分别为25.4%、39.1%和50.6%,差异具有统计学意义(P<0.05),而晚期凋亡比率分别为6.27%、7.58%和8.04%,无统计学差异(P>0.05)。不同浓度槐耳清膏作用于MDA-MB-231细胞48h后,早期凋亡比率分别为1.44%、1.79%和1.56%,晚期凋亡比率分别为5.54%、7.62%和7.99%,差异均无统计学意义(P>0.05)。槐耳清膏各浓度组与MCF-7细胞作用后均可发生细胞增殖抑制,各浓度组作用24h后细胞抑制率分别为(10.7±3.8)%、(42.6±4.3)%、(54.9±4.6)%,作用36h后分别为(15.4±2.2)%、(47.9±5.4)%、(62.7±1.5)%,作用48h后分别为(17.4±1.4)%、(58.6±3.7)%、(76.1±2.9)%,阴性对照组细胞增殖抑制率分别为(2.8±1.3)%、(2.6±1.5)%、(3.1±1.2)%,槐耳清膏各浓度组与对照组之间差异均有统计学意义,P<0.05。通过MTT来测定细胞周期分布情况,槐耳清膏不同浓度组处于G0/G1期细胞比例分别为59.62%、62.19%、65.84%,分布于S期细胞比例分别为15.74%、13.18%、10.94%,分布于G2/M期细胞比例分别为24.64%、24.63%、23.22%,而对照组分布于G0/G1、S、G2/M期细胞比例分别为44.52%、21.87%、33.61%,差异具有统计学意义,P<0.05。荧光显微镜下观察经槐耳清膏处理48h后的MCF-7细胞,可见部分细胞核膜皱缩,核变小,染色质浓聚,荧光明显增强,呈亮蓝色大小不等的碎片状,并可出现浓缩且边缘聚集分布,细胞边缘不太完整,细胞核内可出现浓染致密的荧光颗粒,细胞核可见新月形改变,固缩或片段的核,证明细胞发生了凋亡;而对照组细胞核染色体多呈椭圆形,内有染色较淡的蓝色颗粒,边缘完整清晰。2.在槐耳清膏处理后的乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞中检测与乳腺癌相关的mi RNA表达谱的情况,发现在MCF-7细胞中上调和下调的mi RNA分别有6个和21个,在MDA-MB-231细胞中上调和下调的mi RNA分别有3个和24个,mi R-21-5p在MCF-7及MDA-MB-231细胞被同时上调,有20个mi RNA被同时下调。但在MCF-7细胞中,上调大于2倍的mi RNA有mi R-7-5p、mi R-21-5p、mi R-126-3p,其中mi R-126上调最为明显。结合前期槐耳清膏对MCF-7细胞增殖和凋亡影响显著,所以我们选择经槐耳清膏处理后的MCF-7细胞中,发生上调的mi R-126作进一步研究。槐耳清膏作用于对数生长期的MCF-7细胞48小时后,我们采用RT-PCR的相对定量法来检测mi R-126的相对表达量,结果显示,3mg/m L、6mg/m L和9mg/m L分别是对照组的1.44倍、2.88倍和2.51倍。转染mi R-126 inhibitor或inhibitor control 48h后,通过比较OD490值检测细胞的存活情况。进一步转染了mi R-126 inhibitor或inhibitor control的MCF-7细胞同时用6mg/ml的槐耳清膏处理48h,通过比较OD490值检测细胞的存活情况,发现槐耳清膏抑制乳腺癌细胞增殖的作用明显被削弱。MCF-7细胞转染p RL-TK-SOX2-3’UTR-WT/p RL-TK-SOX2-3’UTR-Mut,Control/mi R-126 mimic及内对照质粒p GL3,48h后进行报告基因检测,共转染p RL-TK-SOX2-3’UTR-WT、mi R-126 mimic和p GL3质粒的MCF-7细胞荧光强度明显低于对照组,而在p RL-TK-SOX2-3’UTR-Mut、mi R-126 mimic和p GL3质粒共转染组中荧光强度与对照组无差异。MCF-7细胞转染Control/mi R-126 mimic 24h和48h后,分别提取MCF-7 RNA和蛋白检测SOX2 m RNA和SOX2蛋白的表达情况,与对照组比较,mi R-126mimic转染组能明显抑制SOX2 m RNA及蛋白的表达水平。3.在裸鼠成瘤实验中,每只裸鼠在接种MCF-7细胞3周后,接种部位均长出肿瘤,成瘤率100%,实验结束后槐耳清膏灌胃组与生理盐水灌胃组移植瘤重分别为0.20±0.07g和0.57±0.32g,实验组裸鼠移植瘤体重明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),移植瘤体积分别为0.32±0.74cm3与0.84±0.62 cm3,实验组移植瘤体积较对照组小,具有统计学差异(P<0.01)。肉眼观察瘤体呈圆形、椭圆形或分叶状包块,质地偏硬,包膜完整,与周围组织大多分界清楚,切面呈灰白色。HE染色,实验组裸鼠移植瘤镜下可见肿瘤组织细胞出现不同程度的退行性变,中央及边缘细胞出现大片缺血坏死区,在血供较丰富的区域表现尤为明显,而在坏死灶周围可见残存的肿瘤细胞。对照组细胞生长旺盛,有异型性,形态不规则,大小不等,细胞核大、浓染,可见病理性核分裂相,无明显坏死区。实验组裸鼠移植瘤组织中表达明显高于对照组,实验组mi R-126的相对表达量是对照组的2.406倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.90例乳腺癌术后患者,随机分为治疗组和对照组,治疗组化疗联合槐耳颗粒口服,对照组单纯行化疗,两组患者在治疗前查外周血NK细胞、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值,分别为(14.73±5.21)%、(55.24±4.36)%、(35.87±4.29)%、(25.34±4.36)%、(1.14±0.35)%与(14.25±4.88)%、(56.21±4.57)%、(35.58±3.17)%、(24.26±3.16)%、(1.16±0.43)%,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗2周期后查外周血NK细胞、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值,分别为(22.74±5.09)%、(65.71±3.95)%、(41.95±6.27)%、(23.72±2.47)%、(1.47±0.26)%与(14.94±5.21)%、(55.34±5.43)%、(34.46±3.25)%、(23.83±3.44)%、(1.12±0.37)%,治疗组治疗后NK细胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值明显高于治疗前,差异具有统计学意义(P<0.05),但CD8+值变化不大,无统计学差异(P>0.05),而对照组各项指标在治疗前后均无统计学差异(P>0.05),治疗后各项免疫指标较治疗前下降。治疗组在患者治疗后NK细胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值均高于对照组患者治疗后相应各项指标,差异具有统计学意义(P<0.05),但CD8+值无统计学差异(P>0.05)。在生活质量评分中,治疗组KPS评分提高22例(48.89%)、稳定20例(44.44%)、下降3例(6.67%),提高率为48.89%,而对照组KPS评分提高7例(15.56%)、稳定33例(73.33%)、下降5例(11.11%),提高率为15.56%,治疗组提高率高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.槐耳清膏对乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有明显的抑制作用,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,这种抑制效果更明显;槐耳清膏能诱导乳腺癌MCF-7细胞的凋亡,具有明显的药物浓度和时间的量效关系;槐耳清膏对乳腺癌MDA-MB-231细胞无明显的抑制增殖和促进凋亡作用。2.槐耳清膏能上调MCF-7细胞中mi R-126的表达,上调的mi R-126可通过抑制靶基因SOX2蛋白的表达参与到槐耳清膏抑制MCF-7细胞增殖和促进其凋亡的作用中,上述研究发现为槐耳清膏的抗肿瘤作用提供了新的分子机制。3.在裸鼠体内,槐耳清膏能抑制乳腺癌细胞MCF-7的成瘤性,其机制可能是槐耳清膏能上调mi R-126的表达,从而达到抑制乳腺癌细胞生长的作用。4.槐耳颗粒能提高乳腺癌术后化疗患者NK细胞、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值,但CD8+值变化不大,证明槐耳颗粒具有良好的免疫增强效果,能增强乳腺癌术后化疗患者的免疫力,改善生活质量,值得临床进一步研究。通过细胞研究、动物实验和临床观察,发现槐耳清膏通过上调mi R-126的表达,进一步调控靶基因SOX2蛋白水平,从而影响乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡。