目的:AnnexinV阳性为微泡表面标记物。流式细胞仪可简便快速的检测AnnexinV阳性的微泡。本实验主要为比较不同溶液溶解的微泡沉淀物,通过流式细胞仪比较哪种溶液溶解的微泡沉淀物更能准确的检测到AnnexinV阳性的比率及微泡的颗粒数。方法:通过梯度离心法提取相等细胞培养上清的微泡,用不同的溶液(生理盐水和PBS)溶解微泡沉淀,分别加入AnnexinV-FITC流式抗体及AnnexinV binding buffer,孵育后上机检测其微泡颗粒数和Annexin V阳性比率。结果:通过流式细胞仪检测,PBS溶解的微泡沉淀比生理盐水溶解的微泡沉淀的AnnexinV阳性率明显高(p<0.01),且微泡大小颗粒数亦明显增多(p<0.01)。结论:溶解微泡沉淀物的PBS可以和流式抗体Annexin V-FITC的binding buffer发生化学反应,形成纳米级别的钙盐磷酸盐沉淀颗粒,对流式结果造成严重的干扰,对微泡的提纯、数量提供错误的信息。在流式细胞学分析微泡过程中,考虑到渗透压的影响,我们推荐盐水比PBS更适合溶解微泡颗粒沉淀。目的:1建立流式细胞仪分析淋巴瘤细胞系及淋巴瘤患者来源的微泡轻链单克隆性表达的方法学,并探讨其潜在的临床价值。2探讨淋巴瘤细胞系及淋巴瘤患者血清来源的微泡基因重排检测的方法学研究及潜在临床价值。方法:1梯度离心法提取淋巴瘤细胞系来源的微泡,使用CD19磁珠进行阳性分选,然后分别标记kappa-FITC及lambda-PE的混合流式抗体,分析CD19阳性微泡的单克隆性表达。2梯度离心法提取淋巴瘤细胞系和患者来源的微泡,使用qiagen公司的micro提取DNA试剂盒提取微泡DNA,再使用全基因组扩增试剂盒进行DNA扩增,扩增后的DNA进行基因重排检测。结果:1 CD19磁珠分选后的微泡标记kappa及lambda混合抗体后行流式细胞学分析,可以检测出单克隆性。2淋巴瘤细胞系及淋巴瘤患者血清来源的微泡提取的DNA进行基因重排,可检测到单克隆峰。结论:流式细胞仪可检测出淋巴瘤细胞系及淋巴瘤患者血清来源微泡的轻链单克隆性表达,微泡提取的DNA行基因重排后可见单克隆峰,充分表明微泡具有潜在替代母体细胞进行检测的可能性。为发展基于微泡的液态活检(microvesicle-based liquid biopsy)提供临床数据及技术支持。目的:1比较淋巴瘤细胞系与其来源的微泡中miRNA表达的差异。2比较两株细胞系和两种微泡之间的miRNA表达差异,通过靶基因预测,基因富集分析,寻找与肿瘤生长密切相关的miRNA和靶基因。方法:梯度离心法提取两株淋巴瘤细胞系微泡,分别提取微泡及细胞系总RNA。通过RNA质量检测后,进行miRNA测序。生物信息学分析差异miRNA。差异miRNA进行靶基因预测,基因富集分析。结果:oci-ly1细胞系中共检测出801个miRNA,与其对应的微泡中检测到679个。oci-ly10细胞系中共检测出1067个miRNA,与其对应的微泡中检测到1031个。两种细胞系中有24个miRNA相同,6个miRNA上调,13个miRNA下调。两种微泡中有28个miRNA相同,5个miRNA上调,19个miRNA下调。上调miRNA靶基因预测基因个数为5790,下调miRNA靶基因预测个数为9542。将预测的上调与下调的基因做交集与差集,发现上调的基因有1006个,下调的基因有4768个,两者共有的基因为4784。使用FunRich和David做富集分析,寻找到与血管新生及促进肿瘤细胞增殖相关的四个靶基因MAPK1,AKT1,PIK3CA,PIK3R1。结论:细胞系与对应的微泡miRNA表达差异相近。来自于两株细胞系及细胞微泡的基因通过富集分析寻找到四个靶基因,均可促进细胞的增殖。我们推测共同表达的miRNA和这四个靶基因与肿瘤细胞的增殖,迁移相关。目的:1观察血液系统肿瘤细胞系(oci-ly1,oci-ly10和k562)来源的微泡对脐静脉内皮细胞(HUVEC)的侵袭,迁移及增殖的影响,以及机制的初步研究。2观察显微注射血液系统肿瘤细胞系来源的微泡促进肿瘤细胞转移的荧光斑马鱼模型。方法:1梯度离心法提取肿瘤细胞系微泡,使用PKH26染料对微泡染色,然后瞬时加入至HUVEC细胞系中,分别观察不同时间点(8H,16H,24H)HUVEC细胞胞吞微泡的量。2微泡刺激HUVEC24H后加入鬼笔环肽,观察HUVEC的形态骨架变化。3流式细胞学检测微泡刺激后的HUVEC周期,EdU(荧光法和流式法)细胞增殖变化。4微泡刺激后的HUVEC的克隆形成,划痕,transwell实验,FITC-detrex渗透实验以及不同时间点细胞的生长密度观察。5微泡刺激后的HUVEC在蛋白水平发生明显变化,Western Blot解释其蛋白水平的变化并初步解释HUVEC生物学功能变化的初步机制。6微泡刺激的HUVEC加入MEK抑制剂U0126后,观察克隆形成,transwell实验,划痕实验的变化。7显微注射斑马鱼卵黄囊,观察肿瘤细胞迁徙的数目。结果:HUVEC可胞吞微泡,在不同的浓度及不同的时间,HUVEC胞吞的量不同。胞吞微泡后的HUVEC形态及细胞骨架发生明显的变化,细胞出现明显的尾足,呈细长状,更利于细胞的迁移。流式细胞学分析HUVEC的周期变化及EdU增殖检测。荧光显微镜观察到HUVEC细胞EdU染色后,微泡刺激的细胞其信号增多(p<0.05)。EdU流式法检测EdU阳性细胞明显增多(p<0.05)。克隆形成提示微泡刺激的细胞集落形成明显增加(p<0.01)。微泡刺激后细胞再培养,微泡刺激后的细胞在不同时间点其细胞密度大于未刺激的HUVEC细胞。荧光酶标提示微泡刺激后的HUVEC其FITC-dextran信号减弱。Transwell(migration和invasion)实验提示微泡刺激后的HUVEC细胞其迁移的细胞数目均明显增加(p<0.01)。划痕实验提示微泡刺激后的HUVEC其增殖和迁移明显大于微泡未刺激的HUVEC。混合微泡和肿瘤细胞进行显微注射至斑马鱼的卵黄囊中,可明显观察到迁移至斑马鱼头部及尾部的肿瘤细胞增多。结论:肿瘤细胞来源的微泡可以引起HUVEC形态发生变化,导致细胞骨架结构发生变化,促进内皮细胞的迁移。而微泡刺激的HUVEC增殖及迁移能力明显增加,更有利于肿瘤细胞的生长。斑马鱼体内实验间接证明,微泡可以促进肿瘤细胞的迁移,其机制可能为微泡导致的血管内皮细胞形态发生变化,以及其增殖及迁移能力增加,导致内皮细胞的通透性发生变化,从而促进肿瘤细胞的迁移。