论文部分内容阅读
成骨不全（osteogenesis imperfecta,OI）是一种间充质组织发育不全,胶原形成障碍而造成的罕见性先天遗传病,遗传方式为常染色体显性或隐形遗传。临床症状表现为骨质脆弱、蓝巩膜、牙本质发育不全、听力障碍等。目前共发现20个基因突变与OI发病相关,90%以上患者病源于编码Ⅰ型前胶原α链的COL1A1和COL1A2基因发生突变,导致胶原合成量下降或结构改变,表现为显性遗传。其余10%左右的患者致病基因种类繁多,与Ⅰ型胶原蛋白代谢密切相关,涉及到胶原翻译后修饰过程、胶原折叠装配及分泌过程异常、成骨细胞分化、钙离子通道、WNT信号通路等骨发育的诸多方面。其中报道的WNT1基因突变导致的成骨不全患者较少,共计25人。WNT1基因突变在成骨不全中的致病分子机制尚不明确,有待进一步深入研究。目的:进一步验证实验室前期成骨不全患者血液样本进行高通量测序发现的WNT1基因候选突变位点,以发现成骨不全患者中WNT1基因的新的突变位点。过表达WNT1突变体,进行TOPflash实验、WNT1蛋白显性负效应实验和Saos2细胞矿化实验。同时,构建circRNA荧光素酶报告载体,进行双荧光素酶报告实验,检测circRNA对靶向WNT1的miRNA的海绵功能。方法:1.提取患者全血基因组DNA,对前期实验室高通量测序发现的WNT1基因候选突变位点进行Sanger测序验证。2.构建WNT1突变体的过表达载体,瞬时转染HEK293T细胞和Saos2细胞,分别进行TOP-Flash实验、WNT1蛋白显性负效应实验和Saos2细胞矿化实验。3.构建circRNA荧光素酶报告载体,瞬时转染HEK293细胞,检测circRNA对靶向WNT1的miRNA的海绵功能。结果:1.在检测的OI患者中,9个WNT1基因的突变位点是未报道过的,分别为c.301C>T、c.382T>G、c.397G>A、c.620G>A、c.677C>T、c.681C>A、c.774C>A、c.937C>T、c.1010G>C。并同时成功构建其过表达载体WNT1 R101C、WNT1F128V、WNT1A133T、WNT1R207H、WNT1S226L、WNT1R313C、WNT1R337P、WNT1C227*、WNT1Y258*。2.在TOPflash实验中,野生型WNT1蛋白作为阳性对照,除S226L突变体外,其余突变型蛋白均与野生型蛋白有显著性差异。3.在显性负效应实验中,野生型WNT1蛋白作为阳性对照,,除Y258*突变型WNT1蛋白外,其余突变型蛋白均与野生型蛋白相比,没有显著性差异,P>0.05。4.在Saos2细胞矿化实验中,根据茜素红染色结果得知突变型WNT1组较野生型WNT1组矿化能力均明显减弱。5.hsacirc001308能够与miR-148a和miR-152结合;hsacirc001319组中miR-152与对照组相比P=0.59,可能与circRNA1319相互作用;hsacirc001372与miR-148a、miR-148b和miR-152相互作用;hsacirc001649与miR-133a结合。结论:新检测的WNT1突变位点丰富了中国OI患者突变表达谱,为研究WNT1导致成骨不全的致病机制提供了新的实验资料。TOPflash实验也间接反映出突变型WNT1蛋白使经典WNT信号通路中β-catenin介导的转录活性降低,矿化实验中突变型WNT1组较野生型WNT1组矿化能力均明显减弱。体外突变体WNT1Y258*似乎有轻微的显性负效应。pmiRGlo-circRNA1308、circRNA1372和circRNA1649能够结合miRNA,具有miRNA海绵功能。