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研究背景及目的:肺癌是世界范围内罹患率最高的恶性肿瘤疾病,随着靶向药物在临床推广使用,表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)基因存在敏感突变的肺腺癌患者约60%在应用第一代EGFR-TKI靶向药物治疗后获得很好疗效,给肺癌的治疗带来转机。然而靶向治疗后病情缓解的患者多在一年左右出现耐药,表现为原发病灶再次进展或出现转移灶等。目前发现肺癌细胞产生获得性耐药的机制主要包括:EGFR基因二次突变,EGFR下游基因突变,旁路信号通路激活和组织学转变等四种。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种分泌型糖化磷蛋白,主要通过整合素传递细胞信号,在多种癌症中发挥促进肿瘤进展或转移等作用。有研究表明OPN在肺癌中表达升高预示了肿瘤预后不佳。本研究发现肺腺癌细胞PC-9对吉非替尼产生获得性耐药后出现黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)异常活化,既往研究表明FAK活化与整合素(Integrin)息息相关。因此,本研究通过体外实验和临床标本检测等实验方法以期阐述肺腺癌细胞中OPN通过整合素介导FAK旁路激活导致获得性耐药的分子机制,并探索针对性的治疗策略。研究方法:1、通过免疫印记(Western Blot)实验检测敏感亲本株PC-9及其吉非替尼耐药株PC-9GR(PC-9gefitinib-resistant)细胞在第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制齐(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)吉非替尼作用下的蛋白活性;蛋白阵列芯片对比PC-9和PC-9GR细胞内蛋白活性,并通过Western Blot 验证;转染小干扰 RNA(small interfering RNA,si-RNA)在 PC-9GR 细胞中敲弱FAK表达后通过Western Blot观察下游蛋白活性。探索耐药肺腺癌细胞中是否存在旁路激活。2、对PC-9GR细胞联用吉非替尼与FAK抑制剂(FAK inhibitor,FAK-i)VS-6063,或者联用吉非替尼与si-RNA干扰FAK,通过克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞活性实验检测对PC-9GR细胞增殖和凋亡的影响;Western Blot检测蛋白活性。探索耐药肺腺癌细胞中FAK蛋白旁路激活是否介导了耐药性。3、通过蛋白阵列芯片和Western Blot实验对比PC-9细胞与PC-9GR细胞可溶性受体及配体表达;观察PC-9细胞在EGFR-TKI作用下整合素αv、β3的表达及下游蛋白活性。探索耐药肺腺癌细胞中是否整合素αv、β3继发性升高激活FAK。4、在PC-9GR细胞中转染si-RNA干扰整合素αv、β3表达,通过细胞活性实验检测细胞对吉非替尼耐药性;Western Blot实验检测下游蛋白活性。探索耐药肺腺癌细胞中整合素αv、β3继发性升高是否介导了耐药性。5、选取2018年2月至2019年2月间使用第一代EGFR-TKI出现耐药的7例肺腺癌患者,收集耐药前后两次活检的病理切片;通过免疫组化实验检测整合素αv表达,进行定量评分,t检验计算表达水平的是否存在差异。探索临床实际中肺腺癌细胞耐药后整合素是否继发性升高。6、通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Western Blot 实验和酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),对比 PC-9 细胞和 PC-9GR 细胞 OPN 的信使 RNA(message RNA,mRNA)、蛋白和分泌水平;检测PC-9在吉非替尼作用下OPN的mRNA、蛋白和分泌水平的变化。探索耐药的肺腺癌细胞中是否存在OPN继发性升高。7、在PC-9细胞培养基中加入重组人骨桥蛋白(rOPN),以及在PC-9细胞中转染si-RNA干扰OPN表达,通过免疫荧光实验检测整合表达;Western Blot实验检测下游蛋白活性。探索耐药肺腺癌细胞中OPN是否激活整合素并导致了 FAK旁路激活。8、在PC-9GR细胞中转染si-RNA干扰OPN的表达,通过细胞活性实验检测细胞对吉非替尼的耐药性;ELISA实验检测OPN分泌水平;Western Blot实验检测下游蛋白活性。探索耐药肺腺癌细胞中OPN是否介导了耐药性。研究结果:1、PC-9GR细胞中p-EGFR虽然可以被吉非替尼抑制,但下游信号分子AKT、ERK(extracellular regulated protein kinases)仍存在部分活化现象,进一步检测发现FAK存在继发性活化;PC-9GR细胞中敲弱FAK表达后,检测发现p-AKT、p-ERK下降。上述结果表明获得性耐药的肺腺癌细胞PC-9GR中存在FAK异常激活,并且可激活下游信号 AKT、MAPK(mitogen-activated protein kinase)通路。2、PC-9GR细胞联用VS-6063和吉非替尼后,克隆形成实验显示增殖能力被抑制;凋亡实验显示凋亡细胞增加;Western Blot检测发现AKT通路显著阻滞,细胞S期标志蛋白减少,凋亡蛋白增加;此外,PC-9GR细胞中敲弱FAK表达后,可降低对吉非替尼的耐药性,Western Blot检测结果提示抑制了 AKT、MAPK通路活性。3、进一步蛋白芯片检测结果发现,PC-9GR细胞中整合素αv、β3蛋白相比PC-9细胞升高;经时间梯度下低剂量吉非替尼作用后,发现敏感亲本株PC-9细胞中整合素αv、β3蛋白升高,FAK通路激活,并进一步引起下游信号分子AKT、ERK蛋白活化;这种获得性的旁路激活,在PC-9细胞中干扰整合素αv表达后无法再现。提示肺腺癌细胞中FAK蛋白的活化可能是通过整合素αvβ3二聚体介导。4、PC-9GR细胞中干扰整合素αv和β3表达后对吉非替尼耐药性减弱;PC-9GR细胞中干扰整合素αv和β3表达后FAK、AKT、ERK蛋白活性下降。提示耐药肺腺癌细胞中整合素αv和β3可以通过活化下游蛋白介导耐药。5、7名耐药患者中有5名(71.4%)出现整合素αv表达升高,通过定量分析存在统计学差异(p=0.041),提示临床上肺腺癌患者对第一代EGFR-TKI耐药后存在整合素表达升高。6、进一步蛋白芯片结果发现,PC-9GR细胞相比PC-9细胞骨桥蛋白(OPN)表达升高,其中主要是分泌型骨桥蛋白(soluble OPN,sOPN)增多;在敏感亲本株PC-9细胞中,吉非替尼作用下发现OPN mRNA表达升高,分泌sOPN增多。提示肺腺癌细胞在EGFR-TKI作用下,早期OPN就会出现继发性升高。7、PC-9细胞加入外源性人重组rOPN后,检测发现细胞膜整合素αv分布增多,并导致FAK蛋白旁路激活;PC-9细胞中干扰OPN表达后,发现在吉非替尼作用下不再发生FAK活化。提示肺腺癌细胞中OPN继发性升高可通过整合素αvβ3活化FAK。8、PC-9GR细胞干扰OPN表达后分泌sOPN减少,对吉非替尼耐药性降低,FAK、AKT、ERK蛋白活性下降。提示耐药肺腺癌细胞中OPN可通过活化下游蛋白介导耐药。研究结论:肺腺癌细胞在吉非替尼作用下OPN继发性升高,其中主要是分泌型sOPN增多,并通过整合素αvβ3二聚体进而旁路激活FAK蛋白,从而引起EGFR下游的AKT、MAPK通路的活化,导致敏感细胞株获得性耐药。降低耐药肺腺癌细胞中OPN和整合素αv、β3的表达以及抑制FAK蛋白的活性可以削弱细胞耐药性。本研究为EGFR-TKI耐药的肺腺癌患者提示了新的治疗策略。