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目的:TP63是p53家族的成员之一,与p53在结构和功能上都有很多相似之处。本研究主要探索TP63的其中一个亚型TP63α在吸烟诱导肺癌发生上皮间质转化(EMT,Epithelial-mesenchymal transition)及侵袭转移中的作用及姜黄素的干预研究。通过香烟处理肺癌细胞,观察到细胞发生EMT/侵袭转移以及TP63α表达水平改变;转染TP63α联合香烟处理肺癌细胞,探索TP63α对香烟诱导肺癌EMT/侵袭转移的调控作用。姜黄素单独或联合香烟处理肺癌细胞,观察TP63α表达水平是否发生改变,推断姜黄素能通过调控TP63α表达发挥干预作用,为姜黄素干预肺癌EMT/侵袭转移提出新的思路及理论依据。方法:1、用不同浓度的香烟烟雾悬液(CSE,Cigarette Smoke Extract)处理肺癌细胞A549和H1299,MTT法测定其细胞活力;然后选取合适浓度的CSE处理A549和H1299细胞,观察细胞的形态变化;细胞划痕实验和Transwell小室观察经CSE处理后,A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的改变;Western blotting及琼脂糖凝胶电泳观察经CSE处理后,A549和H1299细胞上皮标志分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1);间质标志分子N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin);基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9;转录因子Snail1和c-myc以及TAp63α、△Np63α的蛋白和mRNA水平的改变。2、转染TAp63α质粒联合CSE共同处理A549和H1299细胞,观察细胞形态的改变;细胞划痕实验和Transwell小室观察细胞迁移及侵袭能力的改变;Western blotting及实时定量RT-PCR观察细胞的EMT相关指标及TAp63α的蛋白和mRNA水平的改变。3、转染△Np63α-siRNA联合CSE共同处理A549和H1299细胞,观察细胞形态的改变;细胞划痕实验和Transwell小室观察迁移及侵袭能力的改变;Western blotting及实时定量RT-PCR观察细胞的EMT相关指标及△Np63α的蛋白和mRNA水平的改变。4、用不同浓度的姜黄素(Curcumin)处理肺癌细胞A549和H1299,测定其细胞的MTT活力;然后选取合适浓度的姜黄素处理A549和H1299,观察细胞的形态变化;Western blotting观察经姜黄素处理后,A549和H1299细胞的EMT相关指标及TAp63α、△Np63α的蛋白水平的改变。5、用姜黄素和CSE联合处理A549和H1299细胞,观察细胞的形态变化;Transwell小室观察经姜黄素和CSE联合处理后,A549和H1299细胞迁移及侵袭能力的改变;Western blotting观察经姜黄素和CSE处理后,A549和H1299细胞的EMT相关指标及TAp63α、ANp63α的蛋白水平的改变。结果:1、吸烟对A549和H1299细胞活力的影响用不同浓度的CSE连续处理A549和H1299细胞4天,用MTT法判定其对A549和H1299细胞活性的影响。结果显示,CSE在较低浓度时(0.2%、0.5%、1.0%)对细胞没有明显毒性;而在较高浓度(2.0%、4.0%)时,则出现明显的细胞毒性。因此,选择浓度为0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%的CSE开展后续相关实验。2、吸烟引起A549和H1299的细胞形态和迁移/侵袭能力改变用0%、0.2%、1.0%的CSE连续处理A549和H1299细胞4天,显微镜下观察到细胞形态随着CSE浓度增加,A549细胞由多角形变为长梭形;H1299细胞由椭圆形变为长梭形。细胞划痕实验和Transwell小室观察经CSE处理后,细胞迁移及侵袭能力改变;随着CSE浓度的升高及处理时间增加,向划痕中心迁移的细胞增多,呈剂量和时间依赖性变化;细胞的迁移和侵袭能力也明显提高。3、吸烟引起A549和H1299细胞的EMT相关分子的蛋白及mRNA水平改变不同浓度的CSE处理A549和H1299细胞4天,Western blotting结果观察到,随着CSE浓度的升高,细胞的上皮标志分子E-cadherin、ZO-1的蛋白水平降低;间质标志分子N-cadherin和Vimentin、基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9、转录因子Snail1和c-myc的蛋白水平升高;琼脂糖凝胶电泳结果显示,随着CSE浓度的升高,细胞的上皮标志分子E-cadherin、ZO-1的mRNA水平降低;间质标志分子N-cadherin、Vimentin的mRNA水平升高。4、吸烟引起A549和H1299细胞TP63α的蛋白和mRNA水平改变用不同浓度的CSE处理A549和H1299细胞4天,Western blotting和琼脂糖凝胶电泳结果显示随着CSE浓度的升高,TAp63α的蛋白和mRNA水平降低,△Np63α的蛋白和mRNA水平升高。5、转染TAp63α质粒可以改善吸烟引起的A549和H1299的细胞形态、迁移及侵袭能力改变在A549和H1299细胞中转染TAp63α质粒使其高表达,再联合CSE处理细胞4天,观察细胞形态、迁移侵袭能力的改变。细胞划痕实验和Transwell小室结果显示,TAp63α高表达并不影响细胞的形态、侵袭和迁移的能力;而与单独CSE处理组相比,联合处理组细胞形态呈上皮样,细胞的迁移、侵袭能力明显下降。6、转染TAp63α质粒可以改善吸烟引起的A549和H1299的EMT相关分子及TAp63α的蛋白和mRNA水平改变在A549和H1299细胞中转染TAp63α质粒使其高表达,再联合CSE处理细胞4天,Western blotting和实时定量RT-PCR结果显示,高表达TAp63α能上调细胞上皮标志分子E-cadherin、ZO-1的蛋白和mRNA水平;并下调间质标志分子N-cadherin、Vimenin的蛋白和mRNA水平。CSE与转染TAp63α质粒联合处理组与单独CSE处理组相比,N-cadherin、Vimentin、Snail1和c-myc的表达下降;E-cadherin和ZO-1的表达升高。7、转染ANp63α-siRNA能逆转吸烟引起的A549和H1299细胞形态、迁移/侵袭能力改变在A549和H1299细胞中用siRNA抑制ANp63α的表达后,观察CSE对转染后细胞形态、迁移、侵袭能力的影响。结果显示,低表达△Np63α后,细胞形态由间质样形态向上皮样形态转化;细胞划痕实验和Transwell小室结果显示,与空载组相比,细胞的侵袭和迁移能力明显受到抑制。同时,△Np63α的低表达能逆转CSE所引起的细胞形态由上皮向间质的转化及细胞迁移和侵袭能力的增强。8、转染ANp63α-siRNA能逆转吸烟引起的A549和H1299的EMT相关分子和ANp63α的蛋白和mRNA水平改变Western blotting和qRT-PCR结果显示,低表达的△Np63α能上调上皮标志分子E-cadherin、ZO-1的蛋白和mRNA表达;下调间质标志分子N-cadherin、Vimentin的蛋白和mRNA表达。并且低表达的△Np63α能逆转由CSE所引起的E-cadherin、ZO-1的表达减少以及N-cadherin、Vimentin的表达升高。9、姜黄素对A549和H1299细胞活力、形态和相关分子的影响用不同浓度的姜黄素连续处理A549和H1299细胞4天,观察细胞活力变化、形态变化及细胞迁移、侵袭能力的变化;最后选择2.5μM、5.0μM、7.5μM作为后续实验浓度。结果显示,经姜黄素处理后,A549细胞由短梭形变为椭圆形,H1299细胞由椭圆形变为圆形;Western blotting结果显示,随着姜黄素浓度的升高,细胞的上皮标志分子E-cadherin、ZO-1的蛋白水平升高;而细胞间质标志分子N-cadherin、Vimentin的蛋白水平降低。并且随着姜黄素浓度的升高,基质金属蛋白酶MMP-2及MMP-9的蛋白水平降低。10、姜黄素引起A549和H1299细胞TP63α蛋白水平改变不同浓度的姜黄素连续处理A549和H1299细胞4天后,Western blotting结果显示,随着姜黄素浓度的升高,细胞的TAp63α蛋白水平升高;△Np63α蛋白水平降低,并呈剂量依赖性变化。11、姜黄素可以改善吸烟引起的A549和H1299细胞的形态改变、迁移/侵袭能力的改变用姜黄素和香烟烟雾悬液联合处理A549和H1299细胞4天。细胞拍照及Transwell小室结果显示,姜黄素可以改善由香烟暴露引起的细胞形态改变、细胞迁移/侵袭能力增强。12、姜黄素可以改善吸烟引起的A549和H1299细胞的EMT相关分子、TAp63α和ANp63α的蛋白水平改变Western blotting结果显示,姜黄素与CSE联合处理组与单独CSE组相比,A549和H1299细胞上皮标志分子E-cadherin和ZO-1表达上调;间质标志分子N-cadherin和Vimentin、基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9表达下调;同时,姜黄素可以改善CSE所引起的TAp63α的低表达和△Np63α的高表达。结论:吸烟暴露能诱导肺癌细胞发生EMT/侵袭转移的发生,TP63α表达水平改变,这表明TP63α可能在吸烟诱导的肺癌EMT/侵袭转移过程中起到重要的调控作用;通过转染TAp63α质粒和△Np63α-siRNA,发现高表达的TAp63α或低表达的△Np63α可以逆转吸烟诱导肺癌细胞的EMT/侵袭转移的发生。姜黄素是一种植物化学物,可以抑制肿瘤的发展,用姜黄素单独或联合吸烟处理肺癌细胞后,可以改变或逆转TP63α表达水平,因此推断姜黄素可能通过调控TP63α的表达抑制肺癌细胞的EMT/侵袭转移。