2019新型冠状病毒引起的新冠肺炎作为全球流行的传染病给人们的生命健康安全带来了严重威胁,目前还没有研发出针对新冠病毒具有100%疗效的药物。中和抗体疗法是预防和治疗新冠病毒感染的有效手段,且相比于疫苗,中和抗体在已感染病人的应急治疗中具有明确、立竿见影的治疗效果,这一点在埃博拉病毒疫情的药物开发中已得到充分证实。纳米抗体作为单域抗体,是目前已知能与抗原结合的最小片段,分子量小且稳定,在传染病的治疗中可以通过呼吸道给药为疾病的治疗带来极大的方便。使用纳米抗体作为中和抗体用来治疗新冠病毒引发的新冠肺炎是目前非常具有前景的治疗手段。毕赤酵母作为异源蛋白表达常用宿主,常用于生产医药蛋白。有研究人员在大肠杆菌和毕赤酵母中同时表达二价纳米抗体,结果发现在毕赤酵母中表达的纳米抗体比在大肠杆菌中表达的纳米抗体具有更高的中和活性,这可能是毕赤酵母更有利于二硫键的形成。本课题以之前研究筛选得到的潜在的可以中和新冠病毒的纳米抗体,即对新冠病毒RBD结构域具有高亲和力的纳米抗体为研究对象,建立表达该纳米抗体的重组毕赤酵母,主要研究内容和研究结果如下所示:（1）纳米抗体A1表达菌株的构建:以AOX1为启动子,p HKA为载体,构建了N端连接6×His-tag和肠激酶位点的单价价纳米抗体A1表达质粒p HK-AOX-A1,将重组质粒整合到毕赤酵母GS115中,通过SDS-PAGE、蛋白浓度测定、蛋白纯化、ELISA等试验证明了重组毕赤酵母能够分泌表达单价纳米抗体,且能和抗原RBD-Fc结合,是活性表达,摇瓶发酵96 h上清蛋白浓度达0.24 g/L。（2）纳米抗体A3的设计及表达菌株的构建:为了提高纳米抗体的亲和力,设计纳米抗体的二价形式,由两个A1的氨基酸序列通过Linker GGGGSGGGGS相连,同时为延长纳米抗体的半衰期为后续临床试验提供有利条件,在二价纳米抗体氨基酸序列后通过Linker GGGGSGGGGS连接了抗人源血清白蛋白的纳米抗体nb HSA,得到三结构域纳米抗体A3。以AOX1为启动子,p HKA为载体,构建A3表达质粒p HK-AOX-A3,将重组质粒整合到毕赤酵母GS115中,通过SDS-PAGE、蛋白浓度测定、蛋白纯化、ELISA等试验证明了重组毕赤酵母能够分泌表达纳米抗体A3,并比较了A1和A3两种形式的纳米抗体表达量和活性,结果表明虽然A3表达量不及A1,但对抗原的结合活性提高了（3）组合策略提高纳米抗体表达量:虽然纳米抗体活性提高,但是表达量却有所下降,为提高A3表达量,通过启动子替换、增加基因剂量等分子操作提高其表达量,最终纳米抗体A3表达菌株发酵液上清蛋白浓度达到0.44 g/L。在表达量提高的基础上对其发酵工艺进行优化,结果表明纳米抗体A3表达菌株最适温度为30°C、最适甲醇浓度为1.5%,发酵起始p H对纳米抗体的表达量影响不大。对上述得到的纳米抗体表达量最高的重组酵母菌株GS115/p HK-AOXm-A3/Zα-AOXm-A3进行15 L罐放大培养,甲醇诱导96 h后蛋白浓度达2.02 g/L,相比摇瓶水平提高了3.59倍。（4）亲和力鉴定:纯化纳米抗体A3,基于生物薄膜干涉光谱技术（BLI）测定了不同浓度的纳米抗体与新冠病毒RBD蛋白的亲和力,结果显示不同浓度的纳米抗体具有相同的亲和力,亲和常数为KD=1.29×10-10,证明重组酵母表达的纳米抗体对新冠病毒RBD结构域具有较高亲和力。