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【背景】原发性肝细胞癌是全球普遍存在的恶性肿瘤,因其起病急、诊断率低,手术治疗有极大的局限性。药物治疗是肝癌晚期患者治疗的主要手段,临床各项研究表明多药物的联合治疗对肝癌具有一定的疗效。5-氟尿嘧啶是一种经典的抗癌药物,然而临床应用发现其存在耐药性和细胞毒性等问题,使得其抗癌功效有限。近年来,5-FU（5-fluorouracil）与其他药物联合使用已被广泛用于各种癌症的临床治疗。咖啡因是一种结构明确,作用广泛的甲基黄嘌呤类精神药物,近年来越来越多的报道表明,咖啡因除了传统意义上的致兴奋作用,还能降低各类癌症的风险,如胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、肝癌等。有研究表明,咖啡因联合顺铂及阿糖胞苷不仅能显著抑制裸鼠皮下成瘤模型中胰腺肿瘤的生长,还能增加顺铂对肝癌细胞的抑增殖和促凋亡作用,该实验证实咖啡因可以通过促进肿瘤对化疗药物的敏感性而改善患者的耐受性、延长生存期。以上研究为5-FU和咖啡因的新组合提供了理论依据。因此,我们研究5-FU和咖啡因联合应用协同抗肝癌作用和机制。【目的】探讨咖啡因和5-氟尿嘧啶联合应用的抗肝癌作用及分子机制。【研究方法】1.MTS实验检测咖啡因和5-FU单独处理对肝癌细胞增殖作用的影响。2.MTS实验检测咖啡因和5-FU联合用药OD值、计算联合指数CI值,采用平板克隆实验评价咖啡因联合5-FU对肝癌细胞增殖抑制的协同效应。3.采用TUNEL/DAPI染色法评价咖啡因联合5-FU对肝癌细胞凋亡的影响。4.采用Western Blot实验检测药物作用对肝癌细胞凋亡、周期相关蛋白表达的影响。5.采用Transwell实验观察咖啡因联合5-FU对肝癌细胞侵袭、迁移的影响。6.采用DCFH-DA（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）流式细胞技术评价咖啡因联合5-FU对肝癌细胞活性氧（ROS,Reactive oxygen species）生成的影响。7.采用Western Blot实验方法评价咖啡因联合5-FU对MAPK（Mitogen-activat ed protein kinase）通路的影响。8.采用裸鼠皮下成瘤方法评价咖啡因联合5-FU对体内肝癌细胞增殖、凋亡作用的影响。【结果】1.咖啡因能抑制肝癌细胞SMMC-7721、Hep3B的活性,具有剂量依赖性,随着浓度增加,抑制增殖能力增强,其IC50分别为2.211mM、2.026mM。5-FU剂量依赖性地抑制肝癌细胞SMMC-7721、Hep3B的增殖作用,其IC50分别为135.2μM、158μM。2.咖啡因（0,0.5,1mM）和5-FU（0,25,50μM）联合应用后,能抑制肝癌细胞的增殖能力,联合组克隆形成率明显减少,联合指数CI值均<1,差异有统计学意义。选择联合应用抑制率约为50%且CI值<1的1mM咖啡因和25μM 5-FU联合应用进行后续研究。3.TUNEL/DAPI双染检测结果显示,咖啡因联合5-FU可明显诱导肝癌细胞的凋亡发生,差异有统计学意义。4.Western Blot实验结果显示咖啡因联合5-FU后凋亡蛋白明显高于对照组、单药组,并且能下调周期蛋白。5.Transwell实验结果显示咖啡因联合5-FU可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,差异有统计学意义。6.咖啡因联合5-FU作用ROS生成明显高于对照组、单药组,差异有统计学意义。7.咖啡因联合5-FU可以影响MAPK信号通路蛋白。8.咖啡因与5-FU联合用药可抑制裸鼠皮下瘤的生长。【结论】1.咖啡因和5-FU联合使用抑制肝癌细胞的增殖作用具有剂量依赖性和时间依赖性。2.咖啡因与5-FU联合使用可通过抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡发挥协同抗肝癌作用。3.咖啡因与5-FU联合使用发挥协同抗癌作用可能与诱导ROS生成及影响MAPK信号通路有关。