背景由7个高度保守的色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asp,WD)40结构域组成的激活的蛋白激酶C受体1(Receptor for Activated C Kinase 1,RACK1),是一种支架蛋白,分子量为36 kDa。对肿瘤生物学的进一步研究发现RACK1在肿瘤细胞的凋亡以及增殖活动中发挥了巨大作用。我们课题组也同样揭示了RACK1的过量表达,可以促进肝癌细胞的增殖以及增强肝癌细胞抗凋亡的能力。最近的研究报道提示RACK1在NF-κB信号通路中是一种新的负性调控因子。因此,我们猜测RACK1可能在炎症反应中发挥了重要作用,而炎症反应中的炎症性细胞因子的表达又主要依赖于NF-κB信号通路,并且炎性细胞因子的分泌主要依赖于巨噬细胞,但是现在有关于RACK1调节炎性细胞因子表达的研究局限于利用细胞系进行小RNA干扰,可能有脱靶效应,并且不能反映体内的调控状态。急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia,APL)是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一种特殊类型。其特征是粒细胞在早幼粒细胞阶段分化障碍、造血细胞造血功能异常的疾病,其特征是造血前体细胞的异常增殖而引起的未成熟的造血细胞前体大量累积。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)被广泛应用于APL的治疗,并且取得了巨大的成功,但是,ATRA在临床治疗过程会有严重的并发症,导致ATRA的应用受到了严重的限制。因此急迫需要研制有效的替代治疗或者联合用药方案来克服ATRA的使用局限性。我们课题组曾揭示了RACK1在急性白血病单核细胞(THP1)增殖中发挥了重要作用,但是RACK1在急性早幼粒白血病细胞中发挥了哪些作用仍然不清楚。基于以上分析,我们构建了RACK1髓系条件性敲除小鼠,并利用慢病毒介导的小RNA干扰在急性早幼粒白血病细胞中敲低RACK1,探讨RACK1对正常和恶性髓系细胞分化、存活和炎性细胞因子表达的影响,为急慢性炎性疾病和急性早幼粒白血病的治疗提供新思路。目的利用RACK1髓系细胞条件性基因敲除小鼠为主要模型,探讨在髓系细胞中条件性敲除RACK1后,对内毒素休克模型小鼠存活的影响、对炎性细胞因子分泌的影响及可能的机制研究。在APL细胞中,用携带RACK1短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒敲低RACK1,探讨在恶性肿瘤细胞中瞬时敲低RACK1后,对细胞存活和炎性细胞因子分泌的影响及可能的机制研究。方法1、剪取小鼠的尾巴提取鼠尾DNA;鉴定基因型。2、取四周大RACK1条件性敲除小鼠,分别取骨髓细胞、眼周血以及脾,流式检测细胞的表面marker和凋亡情况,观察条件性敲除RACK1后对髓系细胞发育、存活的影响;3、在APL细胞系中,用携带RACK1 shRNA的慢病毒敲低RACK1后,联合ATRA处理细胞,流式检测细胞的死亡情况、对细胞分化的影响以及收取上清检测细胞炎性因子的变化。4、同样用慢病毒在APL细胞系中敲低RACK1后,联合ATRA处理,同时加入溶酶体自噬抑制剂,流式检测细胞的死亡情况,同时制备全细胞裂解液,western blot检测自噬指标LC3B。5、取四周大小鼠,腹腔注射LPS,浓度为25mg/kg,记录髓系细胞条件性敲除RACK1小鼠的死亡时间,做死亡率曲线。6、取一周大小鼠取骨髓单个核细胞,加50ng/ml M-CSF诱导7天获得骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM),然后加入100ng/mlLPS刺激不同时间,收上清,ELISA检测细胞炎症因子的分泌情况;并用ATPlite分析细胞存活情况。7、同前诱导骨髓源巨噬细胞,然后加100ng/mlLPS刺激不同时间,收全细胞裂解液,western blot检测信号通路中的各个信号分子。8、在RAW264.7细胞系中,携带RACK1 shRNA的慢病毒敲低RACK1后,转染IL-10 promoter活性报告质粒,做Luciferase assay,观察RACK1是否影响IL-10 promoter活性。结果1、RACK1对髓系细胞终末分化和存活的影响首先,我们以敲低RACK1的APL细胞为主要模型,结果表明在APL细胞中瞬时敲低RACK1后联合ATRA能够诱导细胞的凋亡,但是却不影响细胞分化。我们课题组以前的工作揭示了RACK1能够促进自噬。因此,我们猜测RACK1也可能是通过自噬途径从而影响APL细胞凋亡的。而我们用自噬抑制剂处理后结果表明RACK1确实是通过增强自噬保护APL细胞免于凋亡。另外,我们以RACK1条件性髓系敲除小鼠为主要模型,探讨条件性敲除RACK1后对髓系细胞分化和存活的影响。结果表明条件性敲除RACK1后既不影响细胞的分化也不影响静息状态下细胞的存活,但是对LPS诱导后的细胞存活有显著影响。2、RACK1对细胞因子表达的影响我们以敲低RACK1的APL细胞为主要模型,用LPS刺激后ELISA检测结果表明瞬时敲低RACK1后并不影响细胞分化,也不会增强炎性细胞因子的分泌。因此,RACK1可能是治疗急性早有粒白血病的一个新靶点。另外,在RACK1条件性髓系敲除小鼠的模型中,我们检测了内毒素休克反应,结果表明RACK1条件性敲除小鼠的死亡率要远远高于通窝同性别野生型小鼠,所以缺失RACK1后增强了小鼠的炎症反应。因此,我们又进一步检测了炎性细胞因子的表达情况,结果表明无论是炎性细胞因子IL-10的mRNA水平还是蛋白水平均有显著性的下降。3、RACK1调节炎性细胞因子表达的机制探讨我们在以RACK1条件性髓系敲除小鼠为模型,诱导BMDM,探讨RACK1调节炎性细胞因子表达的机制。我们对NF-κB信号通路的western blot结果表明IκBα再合成表达量显著下降。所以,我们在RAW264.7细胞中敲低RACK1,探讨敲低RACK1后是否影响了IL-10promotor活性。结果表明敲低RACK1后IL-10的promotor活性显著性下降。我们又进一步的检测了IL-10promotor截短突变体的活性,结果显示promotor活性也显著性的下降。说明敲低RACK1后主要影响IL-10promotor活性位点主要位点是从上游的158bp处到下游的64bp处的活性。而NF-κB的p50/p50的顺式作用元件主要在IL-10 promotor-55/-46的位置,所以,我们猜测是否是RACK1通过影响NF-κB p50/p50复合物的活性影响了IL-10的转录。为了证明我们的猜测,我们还以p50基因敲除小鼠为主要模型,诱导BMDM,ELISA检测IL-10的表达。结果显示,LPS刺激不同时间后IL-10的表达均有显著性下降。综上所述,说明条件性缺失RACK1后有可能影响了NF-κBp50/p50复合物的活性,进而影响IL-10的表达。结论以RACK1髓系条件性敲除小鼠为主要模型的研究表明,髓系敲除RACK1后并不影响髓系细胞的分化和静息状态下的存活,但影响小鼠对内毒素休克的反应。进一步的研究发现RACK1缺失影响IL-10 promotor从上游的158bp处到下游的64bp处的活性,进而影响IL-10的表达。在APL细胞中瞬时敲低RACK1为主要模型的结果表明,瞬时敲低RACK1后能够诱导细胞的凋亡但是又不会增加ATRA诱导的分化,并且不会增强炎性细胞因子的分泌。进一步的机制研究表明RACK1敲低后联合ATRA诱导APL细胞凋亡是依赖于溶酶体-自噬途径。综上所述,RACK1可能是APL治疗中的一个潜在的理想的新靶点。