随着现代化工业的不断发展,镉暴露到空气、土壤等越来越多,造成严重的环境污染。镉通过食物链进入人体,其在体内清除时间长达40年。镉暴露会对肝、肾、肺等多种器官造成毒性损伤,引发多种疾病,如高血压、高血脂等。重金属会对免疫系统产生毒副作用,但对于脾脏的毒性研究较少。因此本研究探讨镉暴露诱导小鼠脾脏及人B淋巴细胞系Ramos细胞中自噬的产生以及镉毒性的机理。本研究中,以小鼠和Ramos细胞为模型。通过连续喂养一周含镉饲料对小鼠进行镉暴露,建立小鼠镉中毒模型;采用0-5μM的镉处理Ramos细胞24 h,建立细胞模型,通过Western blot确定小鼠和Ramos细胞中自噬生物标识蛋白LC3-II增加,而P62的蛋白水平下降,并呈剂量依赖性。镉暴露致使细胞内绿色荧光强度增强,表明镉诱导细胞内酸性小体增多,以上实验结果说明镉可以促进脾脏组织及Ramos细胞的自噬过程。前期的实验发现VMP1蛋白在镉暴露的小鼠脾脏和Ramos细胞中累积,VMP1是一种含有6个疏水结构的穿膜蛋白,在哺乳动物中发现其与自噬有关。本研究利用RNA干扰技术检验VMP1在镉诱导自噬中的作用,利用siRNA抑制Ramos细胞中VMP1的表达,进而抑制镉暴露诱导的LC3-II上升,说明镉诱导Ramos细胞自噬依赖于VMP1。利用放线菌酮CHX抑制蛋白质的合成,检测Ramos细胞中VMP1蛋白的降解,镉暴露细胞CHX处理后,VMP1的稳定性显著增强,这可能是镉暴露诱导细胞中VMP1蛋白上升的主要原因。据报道活性氧(ROS)是诱发自噬的主要原因之一,本研究发现镉可以诱导细胞中ROS和钙离子上调,用ROS的清除剂生育酚TCP处理Ramos细胞后,镉诱导的ROS和钙离子上调受到抑制,同时镉诱导的自噬也被抑制。用钙离子通道IP3受体抑制剂2-氨基乙基二苯硼酸酯2-APB预处理Ramos细胞后,检测发现ROS没有显著变化,然而细胞质中钙离子的上调受到抑制,镉诱导的VMP1和LC3-II上升也受到抑制。这些结果表明镉产生的ROS对自噬的诱导依赖于细胞内钙离子的上调和VMP1蛋白的增加,并且在镉激活自噬的信号通路中,钙离子和VMP1蛋白是ROS的下游。采用流式细胞仪和Western blot研究镉暴露的Ramos细胞发现镉存在时Aninxin V阳性细胞增多并且凋亡标识蛋白表达PARP、Caspase3上升。自噬抑制剂CQ能够减缓镉诱导凋亡蛋白PARP、Caspase3的表达,阻止Aninxin V阳性细胞增多。并且抑制镉导致细胞膜破裂释放乳酸脱氢酶(LDH)。这些结果说明镉在Ramos细胞中诱导的自噬可以促进细胞凋亡。