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我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条新的cDNA序列,经NCBI比对分析后确定其为一未知基因,命名为BmL130(Bomby.moriL130)。BmL130基因长为135.bp,开放阅读框大小为96.bp,预测该基因编码322个氨基酸残基,分子量大小为37.2.kD,等电点为6.40。从GenBank等数据库中利用Blast检索,发现与Bomby.mor.EST序列同源性较高的均为一些假想蛋白,这些蛋白功能未知。
我们根据cDNA序列的ORF框设计上下游引物,PCR扩增后经Bam.I和Xh.I双酶切,插入融合表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点,成功构建重组融合蛋白表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。IPTG诱导后裂解菌作SDS-PAGE分析,在4.kD处有一浓集特异性蛋白条带,重组蛋白以包涵体的形式表达,通过亲和层析纯化了重组蛋白,并使用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价达1:12800。利用荧光定量PCR和Wester.blotting的方法,对BmL130在家蚕各时期和五龄幼虫各组织的转录和表达水平进行分析。实验结果表明:BmL130在家蚕不同发育时期,成虫期最高,其次为幼虫和蛹期,卵期则最低;在不同组织中,以睾丸中最高。BmL130蛋白在家蚕的睾丸中有表达,但在其他组织中没有检测到该蛋白的存在,推测其可能与家蚕的生殖发育有关。