目的三阴性乳腺癌是极具侵袭性的一种乳腺癌亚型,特殊的分子学背景决定了其无法从传统的激素疗法或靶向治疗中获益。成功的三阴性乳腺癌管理仍然是一个难以捉摸的课题,迫切的需要新的临床治疗策略来改善这种情况。中药复方漏芦散有着良好的临床疗效基础,但是缺乏现代化作用机制的有效阐发。以漏芦散干预三阴性乳腺癌为课题基础,引入整合药理学模型的概念,从预测模块和实验验证模块出发,阐发漏芦散的药效物质基础以及三阴性乳腺癌的风险靶标,寻找漏芦散干预三阴性乳腺癌的潜在生物学机制。方法1.回顾性筛选就诊于本院的三阴性乳腺癌患者,提取患者就诊资料和病历信息,分析三阴性乳腺癌患者的证型分布特征。进一步基于Q-Orbitrap高分辨液质联用对漏芦散化学成分进行鉴定,并基于相关“中药-成分-靶标”数据库预测作用靶点,构建药靶网络,从分子层面探究分析漏芦散的有效性机理。2.从高通量数据库中获取三阴性乳腺癌的测序数据,基于生物信息学算法分析处理大数据,降维筛选获得三阴性乳腺癌的关键风险靶标信息。针对关键靶点和通路进行数据集验证,开展与漏芦散关键成分的分子对接打分,筛选具备有效对接互作模式的药靶。进一步搜集医院三阴性乳腺癌患者的病理样本,开展免疫组化等对关键靶点蛋白质层面进行评估,最终确定漏芦散干预三阴性乳腺癌的关键风险靶标和作用途径。3.采用体内外基础实验分析、验证漏芦散干预三阴性乳腺癌的潜在分子机制。检测漏芦散对三阴性乳腺癌细胞系增殖、迁移以及侵袭等能力的影响;基于流式细胞术检测漏芦散对三阴性乳腺癌细胞周期和凋亡的干预作用;构建同种异体荷瘤小鼠模型,体内实验探究漏芦散对三阴性乳腺癌小鼠瘤体生长的抑制作用,以及对生存周期、生存状态等的影响;最后Western blot探究漏芦散对关键靶蛋白的干预作用。结果1.收集了2017年10月至2021年12月因三阴性乳腺癌来本院就诊并入院接受治疗的患者,按照纳入标准和排除标准进行筛查后共有44名三阴性乳腺癌患者被回顾性的进行评估和分析。结果显示冲任失调证的患者有6人,肝郁痰凝证24人,正虚毒炽证14人。这一结局也与先前的研究相吻合,即大部分三阴性乳腺癌患者的证型集中在肝郁痰凝和正虚毒炽证,这一特点在50岁以上的患者群体中体现的尤为明显。这种证型特征为具备行气散结、清热化痰、解毒消痈功效的漏芦散的临床应用提供了理论基础。进一步基于Q-Orbitrap液质联用与中药活性成分数据库挖掘了漏芦散关键组分51个,阐发了作用靶标392个,富集通路集中在肿瘤发生发展相关途径。2.根据免疫组化及荧光原位杂交检测的纳入标准,从TCGA数据库队列中筛选出三阴性乳腺癌患者样本156例,差异分析筛选并标准截断后获得10719个差异表达基因。WGCNA算法被进一步执行以降维筛选获得了显著风险关联模块（r=0.84,P=1e-72）,相关基因进行通路富集,发现了PI3K/AKT信号通路在漏芦散调控三阴性乳腺癌中的潜在价值。分子对接发掘了通路下游靶标EIF4EBP1以及BCL2A1与漏芦散有效组分的良好对接模式。两者在三阴性乳腺癌中的风险表现被进一步基于医院三阴性乳腺癌患者临床样本的免疫组化进行分析,结果展现出了在三阴乳腺癌中的高表达情况,这与转录组水平的结局相契合,提示了EIF4EBP1以及BCL2A1与三阴性乳腺癌的风险关联。3.体外细胞实验的开展是基于三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231以及MDA-MB-468进行的,MTT实验明确了漏芦散对三阴性乳腺癌细胞的显著活性抑制,漏芦散干预24h的IC50分别是4.919mg/ml和5.156mg/ml;此外,2、4mg/ml剂量组的漏芦散均显著抑制了MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系的迁移和侵袭能力（P＜0.05）;MDA-MB-468细胞系在2mg/ml的漏芦散干预时便显示出显著的细胞凋亡结局,而这一情况在MDA-MB-468细胞系中更加显著,1mg/ml的用药浓度便出现了显著的凋亡（P＜0.01）;对于细胞周期干预而言,在MDA-MB-468细胞中,趋势出现在4mg/ml和8mg/ml的干预之后,G1期细胞比例的降低和G2/M期细胞比例的增加均具有统计学意义（P＜0.01）。而在MDA-MB-231细胞中,G2/M期细胞的增加趋势较MDA-MB-468细胞变化更显著,从1mg/ml浓度时便开始出现G2/M期细胞的增加（P＜0.05）;荷瘤小鼠体内实验发现在漏芦散干预后,低剂量组便显示出有效的瘤体抑制作用,无论是瘤体体积还是质量均较空白对照组有明显减小,差异有统计学意义（P＜0.05）。随着药物浓度的增加,这种抑制作用变得格外明显（P＜0.01）,并且高剂量组显示出与阳性对照组相差不大的结局。生存曲线被绘制来可视化描述荷瘤小鼠的生存情况,结果显示空白对照组的小鼠具有最短的生存期和较高的死亡率,而中剂量组、高剂量组和阳性对照组小鼠的生存情况相差不大（P＞0.05）,提示了漏芦散良好的体内干预瘤体效果,以及对机体的保护作用;Western blot结果显示漏芦散的干预显著抑制了PI3K/AKT通路的表达,并且下游的关键因子BCL2A1以及4EBP1的表达也显著降低（P＜0.05）。结论1.本研究分析了三阴性乳腺癌患者的证型分布特征,为漏芦散方药的有效性提供了中医学理论基础。以肝郁痰凝和正虚毒炽证为典型特征的三阴性乳腺癌患者临床应用漏芦散可谓方证相对。2.基于Q-Orbitrap液质联用和中药药靶数据库的有效发掘,发现漏芦散的关键组分和作用靶点有效富集在肿瘤发生发展相关途径,为漏芦散的干预机制研究提供了基础。3.三阴性乳腺癌高通量数据分析和算法降维质控筛选明确了PI3K/AKT信号通路以及关键枢纽EIF4EBP1和BCL2A1在漏芦散干预三阴性乳腺癌中的潜在作用,相关风险关联在转录组和蛋白表达层面均得到了验证。4.体内外实验表明了漏芦散可以通过调控PI3K/AKT信号通路干预三阴性乳腺癌的进展。5.以网络药理学联合生物信息学作为前期预测模块,基础实验为验证模块的整合药理学模式被认为是有意义的,并且可以释放到其他中医药干预疾病机制的有效发现中。