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目的:薄型子宫内膜合并不孕在临床中较为常见,其产生的不良妊娠结局在辅助生殖技术中尤为突出。干细胞疗法是目前最有前景的疗法之一,且越来越多临床案例的报道证实了干细胞治疗薄型子宫内膜的有效性。本课题组前期动物实验提示,向薄型子宫内膜模型SD大鼠宫腔注射骨髓间充质干细胞(BMSCs)后,用归肾丸汤剂进行灌胃,能够有效促进BMSCs转化为子宫内膜上皮细胞,并提示归肾丸可以通过调控HOXA10来增加内膜容受性。但植入宫腔后的干细胞是如何定向分化为子宫内膜上皮细胞的,其机制是什么,中药能否对此分化过程产生影响等一系列问题还有待解决。故本实验设计为体外细胞实验,将归肾丸水提物直接作用于BMSCs,检测归肾丸水提物对BMSCs增殖分化的影响。并通过下调HOXA10基因的表达,探究HOXA10对PTEN/PI3K/AKT信号通路的调控作用,从而验证归肾丸水提物调控BMSCs增殖分化可能的分子作用机制。方法:1.选取3周龄SD大鼠,获取全骨髓,采用全骨髓贴壁培养法培养纯化BMSCs,用流式细胞仪对所取的P3细胞进行表型鉴定。2.设置归肾丸水提物及17 β雌二醇的药物浓度梯度,运用CCK-8试剂盒筛选药物最佳作用浓度。3.在生物信息学软件Snapgene Viewer 4.2.3上寻找HOXA10基因的特异性靶点,构建3条HOXA10基因的,转染骨髓间充质干细胞,运用Western Blot和qRT-PCR技术检测HOXA10的敲低效率,选取敲低率最高的慢病毒载体。4.将第3代骨髓间充质干细胞分成如下两个大组,六个小组:第一大组(未转染组):组 1.空白对照组,10%FBS+DMEM/F12;组 2.归肾丸组,10%FBS+DMEM/F12,5mg/L 归肾丸水提物;组 3.雌激素组,10%FBS+DMEM/F12,1 × 10-7 mol/L17 β 雌二醇;第二大组(转染组):组4.转染对照组,10%FBS+DMEM/F12;组5.转染+归肾丸组,10%FBS+DMEM/F12,5mg/L 归肾丸水提物;组 6.转染+雌激素组,10%FBS+DMEM/F12,1× 10-7mol/L 17 β 雌二醇。5.药物干预BMSCs培养3天后,用ELISA检测6组细胞上清中ITG α v β 3的表达;免疫荧光法检测波蛋白、角蛋白、LIF、VEGF的表达。6.运用 Western Blot 技术检测各组 BMSCs 中 HOXA10、PTEN、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT等PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。7.运用 qRT-PCR 技术检测BMSCs 中 HOXA10、PTEN、PI3K、AKT 等 PTEN/PI3K/AKT通路相关基因的表达。8.流式细胞技术检测各组BMSCs的周期分布和凋亡率,检测慢病毒、归肾丸水提物对BMSCs周期和凋亡的影响。结果:1.第3代BMSCs细胞排列规则,形态统一。流式细胞仪对其进行表型鉴定,结果:CD34呈阴性,CD44、CD90双阳性率为91.5%,符合骨髓间充质干细胞的特性,可用于后续实验。2.CCK-8筛选促进BMSCs细胞增殖的最佳归肾丸水提物浓度为80mg/L,17 β雌二醇无明显促增殖作用(P>0.05)。3.敲低效果最好的慢病毒载体为3#:pLVSHG01-scramble shRNA,敲低效率达80%,明显优于1#和2#,对应的慢病毒序列为TCTGCTCCCTTCGCCAAATTACTCGAGTAATTTGGCGAAGGGAGCAGA。4.ELISA结果显示6组BMSCs中的ITGαvβ3的表达均为弱阳性,且组间差异无统计学意义(P>0.05);免疫荧光结果显示空白对照组和转染对照组的波蛋白表达呈阳性,角蛋白、LIF、VEGF呈阴性,归肾丸组、雌激素组的波蛋白、角蛋白、LIF、VEGF表达均呈强阳性,转染+归肾丸组、转染+雌激素组的波蛋白、角蛋白、LIF、VEGF表达均呈弱阳性。5.Western Blot技术检测结果显示转染HOXA10基因敲低型慢病毒后的BMSCs中的HOXA10、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表达均低于未转染组(P<0.05),而PTEN蛋白的表达高于未转染组(P<0.05)。未转染组内归肾丸组的HOXA10、PI3K、AKT蛋白表达量最高,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),与雌激素组的组间差异无统计学意义(P>0.05),雌激素组与空白对照组的组间差异无统计学意义(P>0.05);转染HOXA10基因敲低型慢病毒组内各组蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。6.qRT-PCR技术检测结果显示转染HOXA10基因敲低型慢病毒后的BMSCs的HOXA10、PI3K、AKT基因表达均低于未转染组(P<0.05),而PTEN基因的表达高于未转染组(P<0.05)。未转染组内归肾丸组的HOXA10、PI3K、AKT基因表达量最高,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),未转染组内空白对照组与雌激素组的组间差异无统计学意义(P>0.05);转染组内各组细胞中HOXA10、PTEN、PI3K、AKT基因的表达差异无统计学意义(P>0.05)。7.流式结果显示转染HOXA10基因敲低型慢病毒后的BMSCs凋亡率明显高于未转染组,未转染组内归肾丸组的细胞凋亡率明显低于空白对照组和雌激素组,对比差异具有统计学意义(P0.05)。结论:归肾丸水提物直接作用于骨髓间充质干细胞,具有促增殖及诱导分化的作用,但促进增殖和诱导分化时的药物浓度有所不同,当浓度在10mg/L--100mg/L时,对BMSCs具有促增殖作用,当浓度低于10mg/L时,能够诱导BMSCs向子宫内膜上皮细胞分化。归肾丸组BMSCs的PI3K、AKT蛋白表达明显高于空白对照组,提示归肾丸水提物对PI3K/AKT信号通路有一定的调控作用。中药组BMSCs的HOXA10基因表达量明显高于空白对照组和雌激素组,转染敲低型HOXA10慢病毒后,基因相对表达量的组间差异不显著,推测归肾丸水提物诱导BMSCs分化的分子作用机制可能与其上调HOXA10基因的表达,从而调控PTEN/PI3K/AKT通路有关,尚无直接证据证明雌激素直接作用于骨髓间充质干细胞有促增殖和诱导分化的作用。同时归肾丸水提物组能增加S期细胞,减少GO/GI期细胞,抑制细胞进入静止期。因此能有效抑制细胞的凋亡,同时促进细胞的生长。