目的1.为了获得人泪腺腺样囊性癌细胞,为建立人泪腺腺样囊性癌细胞系奠定前期基础。2.初步了解人泪腺腺样囊性癌细胞的形态学特征,包括细胞形态、生长特点、细胞标志物和电镜结构,为深入了解该细胞提供理论依据。3.证实人泪腺腺样囊性癌细胞中存在肿瘤干细胞样细胞,并进行初步分离培养和血清诱导分化,为深入研究人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞提供理论支持。方法1.实验第一部分：取天津医科大学眼科医院(原天津医科大学眼科中心)2011年5月一例原发泪腺腺样囊性癌患者的新鲜肿瘤组织,采用组织块培养法,获得原代细胞。运用连续传代、机械刮除、反复贴壁和消化排除等方法去除杂细胞。利用相差显微镜、透射电镜、扫描电镜等观察细胞形态。采取细胞免疫化学法检测细胞波形蛋白(vimentin)、广谱细胞角蛋白(cytokeratin, pan)、S-100蛋白、结蛋白(desmin)、CD34等蛋白的表达情况。采用免疫组织化学法检测肿瘤组织vimentin)、cytokeratin (pan)、S-100蛋白、desmin等蛋白的表达情况。消化法绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间。2.实验第二部分：采用无血清培养法从人泪腺腺样囊性癌细胞中分离培养肿瘤干细胞样细胞,并对其进行血清诱导分化,证明其具有自我更新、不断增殖及可逆分化能力。结果1.国内外首次成功获得可稳定传代的人泪腺腺样囊性癌细胞(lacrimal adenoid cystic carcinoma, LACC):组织块原代培养第5天见周围开始有细胞爬出,此后细胞缓慢增殖,第32天进行首次传代,第69天发现典型的上皮样细胞克隆。运用多种方法去除杂细胞,至第8代细胞基本纯化。纯化后细胞己稳定传至100代以上。2. LACC细胞具有以下形态学特征：1)相差显微镜下观察：细胞贴壁生长,核类圆形,核浆比高,核仁数个：核分裂相多见,可见瘤巨细胞；细胞排列不紧密时,细胞可呈长椭圆形、三角形、梭形、多角形等多种形态；细胞排列紧密时,呈多边形的上皮样细胞形态,表现为典型的“铺路石”样生长；密度继续增高时,细胞接触抑制消失。2)透射电镜和扫描电镜下观察：细胞呈现低分化恶性肿瘤细胞的典型特点,核浆比倒置,胞浆少,胞核大,异型性明显；核仁1至数个,核内染色质丰富,常染色质多见,异染色质边集；不同细胞内细胞器发育差别大；细胞间信号沟通丰富,丝状伪足多级分支。3)细胞免疫化学法观察细胞标志物的表达：vimentin、cytokeratin (pan)和S-100蛋白呈阳性,desmin、CD34蛋白呈阴性,与源肿瘤组织染色结果一致。4)细胞生长动力学分析：细胞生长曲线类似“S”形,细胞倍增时间37.1h。3.利用无血清培养基从人泪腺腺样囊性癌细胞中成功获得呈类球形或葡萄串样细胞团生长的人LACC肿瘤干细胞样细胞。LACC细胞接种到无血清培养基24h后,即可观察到细胞团悬浮生长或半贴壁生长,细胞团内细胞形态均一,生长状态良好,随时间和传代增加,细胞团逐渐增大。4.人LACC肿瘤干细胞样细胞团经血清诱导后可贴壁生长,贴壁细胞形态特点与LACC细胞相似。结论1.国内外首次获得纯化的人泪腺腺样囊性癌细胞,为建立稳定、永久的人泪腺腺样囊性癌细胞系奠定了前期基础,为深入研究人泪腺腺样囊性癌的生物学行为机制提供了重要的种子细胞。2.证实了人泪腺腺样囊性癌细胞中存在肿瘤干细胞样细胞,具有自我更新、不断增殖及可逆分化等肿瘤干细胞特性,为人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞的后续研究开辟了前期道路。