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硫元素是参与生命活动的重要非金属元素之一。硫酸盐进入细胞后,由ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)催化生成腺苷-5’-磷腺硫酸(Adenosine-5’-phosphorus sulfate,APS),APS在APS还原酶的催化下生成亚硫酸,或者在APS激酶催化下生成3’-磷酸-腺苷5’-磷酰硫酸(3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate,PAPS)。PAPS是合成硫代葡萄糖苷的原料之一,也是大规模合成肝素类多糖的一个关键原料,是胞内硫酸化反应的唯一硫酸根供体。硫酸转移酶以PAPS为底物硫酸化生成磺酸物,其副产物为3’,5’-二磷酸腺苷(3’,5’-biphosphate adenosine,PAP),生成的PAP在3’腺苷酸酶的催化下生成单磷酸腺苷AMP和无机磷酸。PAPS在生物材料中含量甚微,商品化PAPS价格贵且纯度低。本研究以PAP/PAPS结合蛋白为工具,建立了从生物材料中纯化和富集PAPS的方法,并进行了定量分析。酵母3’,5’二磷酸核苷酸酶(3’,5’bisphosphate nucleotidase,BPNT或者HAL2)可以水解PAP或者PAPS的3’磷酸,分别生成AMP和APS。二价阳离子Mg2+是HAL2结合、水解PAP或者PAPS所必需的,Ca2+代替Mg2+不影响HAL2结合PAP或者PAPS,而影响HAL2的催化功能,导致其不能水解底物的3’磷酸。本研究通过基因克隆、蛋白表达、纯化等手段获得了麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)和HAL2的融合蛋白MBP-HAL2,并以其为PAPS的结合工具,进行PAPS的富集和定量分析。在Ca2+存在的情况下,将纯化的MBP-HAL2蛋白固定在麦芽糖亲和层析柱上,MBP-HAL2蛋白将结合样品中的PAP/PAPS,而不会水解PAP/PAPS。利用EGTA鳌合Ca2+将解离HAL2与PAP/PAPS的互作,从而获得目标分子PAP/PAPS,进一步的HPLC分析可分别定量其含量。结果我们发现大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))中PAP和PAPS的含量分别是1.076±0.007和0.997±0.009 mg/g鲜菌体。PUF(Pumilio and FBF)蛋白是一种RNA结合蛋白,存在于真核生物,主要通过特异性结合靶mRNA的3’-UTR实现基因的转录后调控,参与胚胎形成、细胞发育和分化等过程。PUF蛋白的RNA结合域(RNA binding domain,RBD)与其配对核苷酸的对应密码已经得到解析,且PUF蛋白的多个RBD单元形成刚性较强的RNA结合骨架。有结果表明RNA结合骨架结合于目标RNA编码区可能导致基因下调表达。我们利用此手段,降低大肠杆菌3’-腺苷酸酶编码基因CysQ的表达,以期降低PAP/PAPS的水解,提高大肠杆菌胞内PAP/PAPS的含量。定量的结果显示,在PUF蛋白表达情况下,细菌CysQ的mRNA并没有产生影响。原因可能是CysQ的mRNA在胞内的含量太低,导致不能产生明显的影响;或者设计的PUF蛋白不能有效结合目标Cys Q的mRNA,不能达到下调目标基因的功能,而这些需要开展进一步的研究以阐明相应的机制。综上所述,本研究建立了一种基于MBP-HAL2融合蛋白的PAP/PAPS富集和分析工具。