【摘 要】
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伏马毒素（Fumonisins,FB）是由镰刀菌属等真菌产生的一种次级代谢产物,已有研究表明它可以造成马脑质软化、猪肺水肿乃至增加人类患有肝癌和肺癌的风险。目前生物酶法已被证明可以有效去除伏马毒素污染,但是针对高效伏马毒素降解酶伏马毒素降解酶的报道依然较少。课题组在前期已获得自主知识产权的高效伏马毒素降解酶,本文主要利用基因工程、表达条件优化及高密度发酵等方法,探索伏马毒素降解酶在大肠杆菌中的高效
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（NO.2017YFD0400300）; 国家重点研发计划项目（NO.2018YFA0901700）
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伏马毒素（Fumonisins,FB）是由镰刀菌属等真菌产生的一种次级代谢产物,已有研究表明它可以造成马脑质软化、猪肺水肿乃至增加人类患有肝癌和肺癌的风险。目前生物酶法已被证明可以有效去除伏马毒素污染,但是针对高效伏马毒素降解酶伏马毒素降解酶的报道依然较少。课题组在前期已获得自主知识产权的高效伏马毒素降解酶,本文主要利用基因工程、表达条件优化及高密度发酵等方法,探索伏马毒素降解酶在大肠杆菌中的高效表达策略并优化了高密度发酵条件,从而为我国伏马毒素降解酶的产业化应用奠定坚实的基础。主要研究内容如下:（1）首先本研究在摇瓶水平上对前期获得的伏马毒素降解酶表达菌株进行诱导表达条件的优化。结果表明伏马毒素降解酶Fum-52308、Fum-25443和Fum-77099的最适诱导温度为25℃,最适诱导时间为18 h,最适诱导剂浓度分别是0.2 mM、0.6 mM和0.6 mM。（2）其次对所有的伏马毒素降解酶的蛋白表达水平和酶活力进行比较分析。在最优条件下,Fum56的蛋白表达量最高,Fum-37的表达量是Fum-56的52%,Fum-53的表达量是Fum-56的64%;Fum-37的酶催化能力最高,Fum-53、Fum-56、Fum-52308、Fum-25443和Fum-77099的相对活力分别是Fum-37的55.41%、10.33%、2.4%、3.3%和5.1%。（3）然后研究了纯化标签的不同位置对Fum37的蛋白表达和酶活力的影响。结果发现Fum-N37的表达量和酶活力都是最高的,其中Fum-C37、Fum-N37和Fum-C/N37的表达量分别是Fum-37的1.51倍、2.41倍和1.96倍;Fum-C37、Fum-N37和Fum-C/N37的相对活力分别是Fum-37的1.54倍、3.67倍和2.12倍。（4）进一步研究伴侣蛋白共表达对Fum37的蛋白表达和酶活力的影响。结果发现Fum-N37-pGr07、Fum-N37-pG-KJE8和Fum-N37-pKJE7的表达量分别是Fum-N37的1.254倍、1.147倍和1.102倍;同时Fum-N37-pKJE7、Fum-N37-pG-KJE8和Fum-N37-pTf16的相对酶活力较Fum-N37有一定的提升。（5）为进一步提高目标蛋白的表达水平,继续对重组蛋白进行高密度发酵优化。结果发现,与优化前相比,优化后目标蛋白Fum37占有总蛋白量从16.8%提升到21.14%,目标蛋白Fum37产量从20mg/L提升到670mg/L;Fum53的产量可达到530 mg/L。
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