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重金属铜是生物体必须的一种微量元素,虽然浓度很小,但长期累积也会对生物体产生毒害作用。过量的铜会诱导DNA、细胞膜完整性、呼吸作用以及酶活性发生改变,从而导致生物体生存受到威胁。以细菌为代表的各种生物体为了应对铜毒性不断进化抗铜策略,但铜污染区域一般处于酸性环境,因此细菌在应对铜胁迫的同时也会受到pH值的影响。基于以上内容,分析细菌在不同pH条件下的铜抗性响应机制不仅为全面了解细菌的抗铜性能提供理论支持,还为利用生物修复法治理铜的污染研究提供相应参考。本论文选择密歇根克雷伯菌（Klebsiella michiganensis）作为研究对象,以pH（3,4和5）作为研究变量,分别测定该菌在有无添加铜时的生长曲线。并利用全基因组和转录组测序技术研究K.michiganensis在pH 4和5环境下经铜胁迫后的抗铜机制。利用全基因组测序技术,获得K.michiganensis的基因序列,注释分析与铜抗性相关的基因;通过转录组测序技术获得不同pH条件下铜胁迫后的转录本,筛选与铜抗性相关的显著差异表达的基因和代谢通路,从多个角度分析K.michiganensis对铜的抗性响应机制。具体结果如下:（1）分别测定K.michiganensis在不同pH（3、4和5）条件下有无添加铜（0.5 mM CuCl2）的生长曲线。结果显示,在pH 3条件下添加铜和没有添加铜的菌株无生长现象,暗示该pH条件下菌株生长均受到抑制;在pH 5条件下添加铜和没有添加铜的菌株生长曲线特征相似,暗示该pH条件对铜胁迫后的菌株生长影响相对较小;与之对比,在pH 4条件下添加铜和没有添加铜的菌株生长曲线差异较为明显,暗示该pH条件对铜胁迫后的菌株生长影响较大。因此选择在pH 4和5条件下分别测定K.michiganensis经铜胁迫后的转录情况。（2）菌株K.michiganensis基于Nanopore测序平台进行基因组测序,经过过滤、组装等过程得到细菌完整的基因序列。K.michiganensis基因组编码的5,409个基因,均位于环状染色体上（染色体长度为5,159,508 bp）,不存在质粒。另外,在菌株K.michiganensis上发现cusFAB、cueO、copA等12个铜抗性基因。（3）转录组测序结果显示,在pH 4和5的条件下铜胁迫后大量基因显著差异表达。在pH 4条件下有583个差异基因表达;在pH 5条件下有203个差异基因表达,暗示酸性越强,细菌响应的基因越多。K.michiganensis细胞在pH 4和5条件下暴露于0.5 mM CuCl2时,在较低的pH下（pH<4）菌株的增长受到强烈的抑制,而较高的pH（pH>5）导致培养基中铜沉淀。因此本研究着重分析pH 4条件下铜胁迫的抗性基因及代谢通路。转录组学分析发现,仅在pH 4条件下,与群体感应（QS）（lsrABCDFGKR）和Ⅱ型分泌系统（T2SS）（gspCDEFGHIJKLM）相关的两组基因显著上调。这些结果表明,Ⅱ型分泌系统可能受到群体感应的诱导和控制,从而有助于细胞外聚合物（EPS）的形成和蛋白质的分泌,防止铜离子进入细胞。在pH 4时,6个铜抗性基因（cusABF,copA,cueO和gene05308）上调倍数比在pH 5时高。在pH 4条件下硫同化基因cysHJIK的相对表达水平（log2|FC|）也相对较高。而编码有机硫代谢的基因tauB仅在pH 4时显著上调。这些结果表明铜外排系统可以去除细胞内铜离子;硫同化与铜离子的解毒有关。此外,在较低pH（4）环境下游离铜离子会增加进而诱导细胞之间的通讯信号,从而刺激K.michiganensis中Ⅱ型分泌系统相关基因对铜胁迫的响应。因此,K.michiganensis对铜胁迫的抗性是由细胞内和细胞外成分组成的多系统协同过程。