脓毒症(Sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合,可导致多器官功能障碍甚至死亡。脓毒症是当前重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)面临的棘手难题,是除冠心病外ICU病人死亡的首要原因。一方面因为脓毒症由不同的微生物引起,导致相应的疫苗难以开发;另一方面,由于抗生素的滥用,耐药菌株不断产生,应用抗生素控制感染越发困难。因此,尽管对于脓毒症的发病机制的研究取得了很大的进展,目前对于脓毒症的治疗,仍然没有特效的药物。所以,人们迫切需要发展新型的治疗脓毒症的方法。第一部分DUSP1启动子荧光素酶报告基因RAW264.7细胞体系的建立以及测试丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1(Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1,MKP-1)是一种可诱导的细胞核磷酸酶,能使丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)去磷酸化,因此,它是MAPK活动的负性调控因子。研究发现MKP-1在固有免疫和适应性免疫反应中都是一个关键的内源性负性调控因子,用敲除MKP-1的小鼠研究发现MKP-1对于脓毒症小鼠具有保护作用。而且,某些抗炎药物能使MKP-1的表达和蛋白功能上调,如糖皮质激素,MKP-1也调控它们的抗炎作用。因此,MKP-1可以作为一个潜在抗炎药物作用的靶点。在本研究,我们想明确哪些药物通过上调MKP-1发挥抗炎作用,并且旨在通过上调MKP-1筛选出新的抗炎药物。因此,我们构建了一个含MKP-1基因DUSP1的启动子和荧光素酶报告基因的RAW264.7细胞稳定表达细胞系。通过96孔板逐步稀释法获得了 13个单克隆,其中2个克隆用LPS诱导24 h其荧光素酶活性分别是对照组的7.6和8.8倍;用地塞米松和Rolipram都能使LPS诱导的荧光素酶活性增强;用LPS分别刺激稳定表达细胞6 h、12 h、24 h和36 h发现24 h荧光素酶的生成量达到最高,与刺激时间存在依赖关系。这些数据表明含MKP-1启动子和荧光素酶报告基因的RAW264.7细胞稳定表达体系构建成功,通过96孔板可高效筛选抗炎药物;Rolipram能上调MKP-1启动子的活性,推测Rolipram可能对炎症性疾病如脓毒症和脓毒性休克具有保护作用。第二部分 Rolipram对脓毒症小鼠治疗作用的研究研究发现MKP-1对于脓毒症和脓毒性休克小鼠具有保护作用。我们在第一部分用构建的稳定表达MKP-1启动子荧光素酶报告基因的RAW264.7细胞体系筛选抗生素时发现,Rolipram能增加MKP-1启动子的活性。而且,Rolipram在脓毒症和脓毒性休克小鼠保护作用的研究未见报道。因此我们提出假设:Rolipram对于炎症性疾病如脓毒症和脓毒性休克具有保护作用。为了验证这一假设,我们进行了细胞实验和动物实验,结果发现,Rolipram能使LPS引起的RAW264.7细胞释放炎症细胞因子减少。在动物模型,Rolipram预防性给药能使LPS引起的脓毒症小鼠的存活率从29.2%提高到100%;Rolipram治疗性给药能使LPS引起的脓毒症小鼠的存活率从36.4%提高到100%;用Luminex技术检测小鼠血清发现Rolipram能降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-5、IL-12(p40)的产生,能增强抗炎因子IL-10的生成,能抑制趋化因子MCP-1、IP-10、MIP-1β、MIP-2、Eotaxin、KC、MIG和LIF的生成,以及抑制生长因子VEGF的生成;肺、肝和肾HE染色显示Rolipram能减轻这些器官的损伤。肺泡灌洗液实验发现Rolipram能减轻LPS引起的肺炎症反应,小鼠血清肝和肾生化指标检测发现Rolipram能抑制ALT、AST、Cr和BUN的生成;Western-blot结果显示Rolipram能抑制LPS引起的肺组织NF-κB p65磷酸化以及ERK,JNK和p38 MAPK的磷酸化,免疫荧光结果显示Rolipram能抑制肺组织NF-κB p65入核;Rolipram还能改善致病性大肠杆菌引起的脓毒症小鼠和CLP模型小鼠的存活率。因此我们得出结论,Rolipram能抑制LPS引起的RAW264.7细胞释放炎症细胞因子,对于LPS引起的脓毒症小鼠、大肠杆菌引起的脓毒症小鼠和CLP模型小鼠具有保护作用。本研究表明上调MKP-1可能成为治疗炎症性疾病的策略,如脓毒症和脓毒性休克。Rolipram可用于治疗脓毒症和脓毒性休克,而它是美国批准的用于治疗COPD的药物,这种“Drug re-positionl strategy”相对于开发新药而言,节省了大量的时间、精力和金钱。