目前,通过对胰岛β细胞发育调控基因重编程使脂肪间充质干细胞具有胰岛素分泌功能,从而代替胰岛β细胞用于糖尿病治疗已成为一大研究热点。基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Mafa等是胰腺发育的主要调控基因,它们的突变缺失都会严重破坏胰腺内分泌细胞的发育。通过转基因技术使这些基因在干细胞中过表达,但结果发现单基因转染的定向诱导作用并不明显,要实现干细胞向胰岛素分泌阳性细胞的定向分化还需要其他基因的配合,进而筛选最佳基因组合并通过多基因共表达实现干细胞向胰岛素分泌细胞分化具有重要意义。前期本研究小组已通过绝对定量转录组测序分析筛选出在犬ADSCs向胰岛素分泌阳性细胞分化中可能起作用的新表达调控基因Foxa2、Insm1和Mnx1。因此,本试验前期构建了基因Foxa2、Insm1和Mnx1的真核过表达载体和腺病毒过表达载体,并对其在犬ADSCs中的过表达功能进行验证,对比筛选出功能最佳的新表达调控基因Mnx1。此外,试验中发现真核表达载体筛选周期长,筛选效率低,而腺病毒过表达载体操作简单,感染效率高。因此后期实验中,将基因Mnx1与级联调控关键基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Mafa以2A肽连接,以不同的排列形式构建5组腺病毒介导的多基因共表达载体,包装扩增为高滴度的腺病毒毒液后感染犬脂肪间充质干细胞并对分化效果进行监测。研究结果如下:1. 成功构建重组真核过表达载体pIRES2-EGFP-Foxa2、pIRES2-EGFP-Insm1、pIRES2-EGFP-Mnx1和重组腺病毒过表达载体pAd-Foxa2、pAd-Insm1、pAd-Mnx1,并经PCR鉴定和双酶切鉴定。分别感染犬ADSCs后对比各时间段胰岛β细胞发育调控基因m RNA表达量,显示腺病毒介导的基因Mnx1过表达可显著提高胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4在犬ADSCs中的表达水平,并发现腺病毒的感染效率明显高于真核过表达载体。2. 成功构建五组多基因共表达腺病毒载体pAd-Pdx1-E2A-Ngn3、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mafa-F2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Pax4-E2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mafa-F2A-Pax4。经过酶切、PCR鉴定和测序正确。通过RT-q PCR和Western blot检测发现各组合中目的基因在m RNA水平和蛋白水平都有明显表达。3. 五组多基因共表达腺病毒载体包装扩增后感染犬ADSCs,荧光定量PCR结果显示组合三中基因Pdx1、Ngn3、Mafa和Mnx1共表达后,胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Mafa、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4、Ins、Pcsk2、Slc30a8、Abcc8、Ksnj8、G6pc2表达量显著提高,与其他组合相比差异性显著。感染25 d后形成的类圆形细胞团双硫腙染色后呈现红棕色,提示有胰岛素分泌。组合三腺病毒感染的犬ADSCs在高糖(25 mmol/L)和低糖(5 mmol/L)刺激下,上清液中胰岛素分泌量分别是101.810±4.39μIU/10~5cells和49.439±2.5μIU/10~5cells,其胰岛素刺激释放指数(Stimulation Index,SI)为2.059±0.175,与其他几组呈现显著性差异。结果表明,基因Mnx1过表达可显著提高胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4在犬ADSCs中的表达水平。腺病毒的感染效率明显高于真核过表达载体。腺病毒介导基因Pdx1、Ngn3、Mafa和Mnx1在犬脂肪间充质干细胞中共表达,可高效调控其向胰岛素分泌阳性细胞分化,为进一步探究糖尿病的干细胞替代疗法奠定了基础。