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哺乳动物精子发生是一个复杂而独特的细胞增殖与分化的过程,其中包括精原细胞的有丝分裂增殖,精母细胞的减数分裂和精子细胞的变态过程,最终形成成熟的精子。精子发生过程是一个受到精细调节的众多基因参与的复杂而有序的过程。在这一过程中表达的基因编码在精子发育的不同阶段所必须的蛋白质。染色体核型异常,精子生成相关的基因缺失、突变或表达异常都可能导致精子生成障碍,形成少精子症或无精子症,导致男性不育。LM23基因(AF492385)是本实验室采用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选大鼠精原细胞与精母细胞差异表达基因过程中发现的大鼠睾丸特异表达基因,在心、肝、脑、脾、肺、肾、骨骼肌组织均无表达。Real-time PCR分析显示,该基因在精母细胞中表达丰度高,而在精原细胞和精子细胞中表达微量,提示其在精子发生过程中具有阶段特异表达的特点。本研究期望以生物信息学分析、制备LM23蛋白多克隆抗体、构建LM23原核表达质粒并表达LM23重组蛋白以及利用活体LM23基因沉默大鼠动物模型进行相关研究的方式研究大鼠睾丸特异表达基因LM23的性质、功能和信号转导途径中的关键分子。一、LM23蛋白的生物信息学研究目的：利用生物信息学方法对LM23蛋白的理化性质、结构与功能进行预测,并为下一步的实验策略提供参考。方法：利用互联网公共信息数据库PredictProtein、DNAstar、Protfun server、Expasy、HMM、BLAST、CPHmodles等生物分析工具软件对LM23进行生物信息学分析。结果：LM23蛋白等电点为8.76,分子量为36223.29。LM23蛋白拥有2个N-糖基化位点,7个蛋白激酶C磷酸化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点,2个酰胺化位点。LM23蛋白的二级结构中,螺旋结构占25.64%,折叠结构占7.05%,环状结构占67.31%。通过DISULFIND预测发现LM23蛋白内部没有二硫键。LM23蛋白可能是结构比较松散的球状蛋白。LM23蛋白很可能位于细胞核中,这一点也与我们随后进行的LM23蛋白免疫组织化学定位研究的结果相一致。通过BLAST工具对LM23基因的同源基因进行比对分析,结果发现LM23基因与小鼠、人类的细胞周期相关基因speedy homolog A(Spdya, Speedy)基因具有一定同源性。LM23蛋白可能参与蛋白翻译调节过程,是一种生长因子。另外,本研究利用CPHmodles神经网络进行同源建模,成功预测出LM23蛋白的三维立体结构图。结论：本研究通过生物信息学方法成功实现了对LM23蛋白的理化性质、结构、功能和同源基因的预测工作二、制备LM23蛋白多克隆抗体及鉴定研究目的：利用合成肽抗原方法制备LM23蛋白的合成肽多克隆抗体。方法：首先,利用生物信息学方法分析选择LM23蛋白的多肽序列。应用Fmoc法化学合成大鼠LM23蛋白从N端数第1-20和第274-291个氨基酸多肽(接近C端),经C18的RP-HPLC纯化后,将纯化的LM23蛋白合成多肽与钥孔戚血蓝素(KLH)交联,作为抗原免疫新西兰大耳白兔,获得LM23蛋白的多克隆抗体。ELISA方法鉴定多克隆抗体效价,并通过Western blot方法鉴定LM23多克隆抗体的特异性。利用LM23多克隆抗体研究LM23蛋白在大鼠睾丸中的表达,并通过免疫组织化学方法研究LM23蛋白在大鼠睾丸组织和细胞中的定位情况。结果：通过化学Fmoc法分别合成大鼠LM23蛋白N端第1-20,第274-291个氨基酸多肽,纯化后两种多肽的纯度都达到90%以上,符合免疫用抗原标准。将所合成的LM23多肽与KLH交联,免疫动物。经ELISA鉴定,两种多克隆抗体的效价分别达到1：64,000和1：128,000。应用大鼠睾丸组织切片进行LM23-18肽多克隆抗体的免疫组织化学研究,发现精母细胞有阳性颗粒反应,且存在于细胞核中。Western blot研究证实,LM23-18肽多克隆抗体可特异识别大鼠睾丸组织中相对分子量约为36KD的LM23蛋白。结论：成功制备LM23合成肽多克隆抗体,所制备抗体可用于ELISA、Western blot及免疫组织化学研究,为进一步研究LM23的功能和作用机制提供了有力支持。三、LM23基因重组表达载体的构建和诱导表达研究目的：构建LM23基因的原核表达载体,实现LM23蛋白的原核重组表达,为深入研究LM23蛋白的功能奠定基础。方法：从大鼠睾丸组织中提取总RNA,通过逆转录PCR扩增LM23基因的cDNA序列,对LM23基因的PCR产物进行TA克隆和DNA序列测序分析；阳性TA克隆LM23片段亚克隆入pET28a(+)载体,对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序分析。IPTG诱导表达LM23重组蛋白,并对重组蛋白进行SDS-PAGE电泳及Western blot分析,鉴定其是否为所需目的蛋白。结果：逆转录PCR扩增出约900 bp的DNA片段,TA克隆和DNA序列分析显示重组片段是LM23基因序列,全长939bp；LM23 cDNA亚克隆插入pET28a(+)载体的BamHI和XhoI位点之间,经PCR产物测序证实pET28a(+)-LM23为正确克隆；IPTG诱导表达,裂解细菌。SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实,所获重组蛋白确系所需LM23融合蛋白。结论：本研究通过原核表达方法,成功构建pET28a (+)-LM23原核表达载体,实现LM23蛋白的原核重组表达,为后续的研究奠定了基础。四、LM23蛋白与细胞周期相关蛋白、PIWIL2及生精细胞凋亡关系的研究目的：借助本研究室刘美玲等建立的活体LM23基因沉默大鼠动物模型,研究LM23蛋白与细胞周期相关蛋白、PIWIL2及生精细胞凋亡的关系。方法：使用自制的LM23蛋白多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学方法进一步验证LM23蛋白在大鼠睾丸LM23基因RNAi大鼠动物模型中的表达情况。为了解LM23基因knock down后是否会导致相关生精细胞发生凋亡,对LM23基因RNAi后大鼠睾丸生精细胞的凋亡状况进行TUNEL和Caspase 3抗体免疫组织化学研究。对LM23基因RNAi大鼠睾丸进行基因芯片研究,了解LM23基因knock down后差异表达的基因,并对差异表达基因进行进一步验证。利用CDK1、CDK2、CyclinA1、PIWIL2等蛋白的抗体,进行VVestern blot和免疫组织化学实验,以研究LM23基因knock down大鼠中降调的细胞周期关键蛋白CDK2和CyclinA1,以及精子发生相关蛋白PIWIL2与LM23蛋白的关联。结果：LM23蛋白多克隆抗体Western blot、免疫组织化学检测,LM23基因RNAi大鼠睾丸未发现有LM23蛋白表达。LM23基因RNAi大鼠睾丸组织免疫组织化学结果显示,LM23基因(?)RNAi大鼠精子发生停滞于精母细胞时期,曲细精管管腔内圆型精子细胞很少,极少有成熟的精子。TUNEL研究发现,LM23基因RNAi大鼠睾丸有大量精母细胞发生凋亡。免疫组织化学研究显示,与对照相比LM23基因RNAi大鼠睾丸生精细胞Caspase 3分子的表达量显著增加,提示LM23基因knock down导致大量精母细胞发生凋亡可能是通过Caspase 3途径实现的。LM23基因RNAi大鼠睾丸基因芯片分析结果发现,LM23基因knock down大鼠睾丸的细胞周期关键基因CDK2和CyclinAl,以及精子发生相关基因PIWIL2的表达量显著低于对照组。Western blot和免疫组织化学研究结果证实,CDK1、CDK2、CyclinA1、PIWIL2等蛋白在LM23基因RNAi大鼠睾丸的表达量显著低于对照。结论：研究结果提示,LM23蛋白在大鼠精子发生过程中发挥作用。LM23蛋白主要作用于精母细胞向精子细胞转化时期,如果没有LM23,精子发生将停滞在精母细胞时期。LM23在精子发生过程中的作用可能与细胞周期蛋白CyclinA1、CDK1和CDK2有关。另外,LM23可能与精子发生相关蛋白PIWIL2也存在某种关系。