茶黄素和转化生长因子-β1对兔骨髓基质干细胞向软骨细胞增殖及诱导分化的影响

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目的:茶黄素是红茶中的主要成分,具有调节血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗心脑血管疾病等多种药理活性。以往研究茶黄素对骨髓基质干细胞转化较少,本实验探讨茶黄素和转化生长因子β1(TGF-β1)对体外培养兔骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖及向软骨细胞诱导分化的影响。方法:实验于2008-05/8在安徽医科大学附属省立医院中心实验室完成。①实验动物:清洁级8周龄家兔12只,由安徽医科大学动物试验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:兔全身肝素化后麻醉状态下处死,取双侧股骨和肱骨,去除软组织,切除包括骺板在内的两侧骺端,采用全骨髓法分离培养骨髓基质干细胞,按5×104/L的细胞密度接种,当细胞生长至80%~90%融合时消化传代。取传至第三代的细胞按1×104/ml的密度接种,加入含重组人胰岛素10mg/L、地塞米松10-8mmol/L、TGF-β15ng/L的DMBM成软骨诱导液培养2周。取第3代BMSC分为三组:A对照组,B组:完全培养基加地塞米松(10-8mmol/L)、TGF-β1(5ng/L)、维生素C(10mmol/L)。C组:完全培养基加地塞米松(10-8mmol/L)、TGF-β1(5ng/L)、维生素C(10mmol/L)、茶黄素(30 mg/L)。③实验评估:倒置显微镜下观察细胞生长状况,甲苯胺蓝染色、阿利新蓝比色法测定各板每孔中GAG含量、以及Ⅱ型胶原免疫组化鉴别。结果:①细胞生长曲线:骨髓基质干细胞具有旺盛的增殖能力,培养1d为细胞的适应期,3d为对数增长期,8d时进入平台期,之后细胞增殖迅速减慢,细胞数下降。②观察细胞生长:骨髓中分离获得的BMSCs在体外增殖旺盛,TGF-β1和茶黄素诱导后细胞生长明显减缓。与对照组相比,经过诱导2周后,诱导组BMSCs均与对照组有显著的差异性(P<0.05),诱导组之间也存在差异性(P<0.05)。③甲苯胺蓝染色和免疫组化鉴定结果:经TGF-β1和茶黄素诱导2周后,细胞甲苯胺蓝异染明显,Ⅱ型胶原化学染色阳性,表现为软骨细胞生物学特性。结论:茶黄素(30 mg/L)在TGF-β1存在的条件下能有效促进BMSCs在体外向软骨细胞分化。
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